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坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)是一种严格厌氧的革兰氏阴性杆菌,具有多形性,常引起人的急性咽炎综合征(Lemierre’s Syndrome)和牛、羊、鹿等动物的腐蹄病、肝脓肿、坏死性皮炎、犊牛白喉。目前还没有商品化的坏死梭杆菌疫苗,国内外主要使用抗生素来治疗该病,但是抗生素带来的负面影响越来越受到人们重视,为了研究120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物学特性,并揭示其作为基因工程亚单位疫苗预防坏死杆菌病的可行性,本研究根据已报道的F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列,克隆出该基因完整的核苷酸序列,生物信息学分析了该蛋白的分子特征,参考抗原表位预测结果,将F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的开放阅读框(Open reading frame)分为3个彼此重叠的基因片段p1、p2、p3,进行原核表达,纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔,检测兔血清中特异性抗体水平,主要研究内容如下:1.根据已报道的F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登录号:AF529887.1),采用染色体步移技术,克隆出该基因完整的核苷酸序列并用高保真酶进行验证,全长4 247 bp,含有一个3 372 bp的ORF,编码1 123个氨基酸,蛋白质的分子质量约为120 ku。生物信息学分析表明,该蛋白可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族成员,并具有较强的抗原性。2.F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及纯化。参考抗原表位预测结果,将F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的ORF分为3个彼此重叠60 bp左右的基因片段p1、p2、p3,构建重组表达载体p ET-28a-p1、p ET-32a-p2、p ET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,利用AKTA purifier蛋白纯化系统获得48 ku、59 ku、62 ku的重组蛋白P1、P2、P3,Western blot分析显示,纯化后的重组蛋白P1、P2、P3具有良好的反应原性。3.将纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔,检测兔血清中的特异性抗体,结果显示,兔血清中的抗体效价分别为1:32、1:16、1:16,表明重组蛋白均可诱导实验兔产生特异性抗体,具有良好的免疫原性。综上所述,F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析,为进一步了解120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物学功能提供理论基础,并为基因工程亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了物质材料。