慢生型大豆根瘤菌USDA110胞外多糖的相关基因及其在共生过程中的作用的研究

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近年来,过度使用化学氮肥已经造成了很大的负面影响:土壤肥力下降、肥效低、对环境的污染严重等等。根瘤菌与豆科植物的共生系统是生物固氮体系里固氮能力最强的,且它们的固氮量占了总固氮量过半的比重,因此相关研究者认为应该要最大程度上发挥生物固氮的作用,以减少化学氮肥的使用量。在共生固氮系统中,根瘤菌所产的胞外多糖有着重要的作用,对根瘤菌胞外多糖的研究不仅有助于探索细菌与宿主之间的关系,还能够帮助扩大根瘤菌的宿主范围、改进两者的共生条件、提高共生固氮的效率,同时有助于减少化学氮肥给环境带来的负面影响。此外,许多根瘤菌能够分泌大量高粘度的或有特殊流变性的胞外多糖,在工业上也具有潜在的应用潜力。本研究选择慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110与其特异性宿主大豆这一模式共生体系作为研究对象,探究慢生型大豆根瘤菌胞外多糖在共生过程中的作用,以期提高共生固氮效率和减少化学氮肥的使用量。以慢生型大豆根瘤菌作为建库出发菌株,运用Tn5转座子随机插入突变的方法建立突变库。经过稀释涂布50000多株单克隆的转化子,比较菌落大小和菌落饱满程度,筛选到5株胞外多糖缺失突变株,编号为BJ25、BJ32、BJ33、BJ57、BJ60。其中BJ25与野生型的菌落大小和菌落饱满程度相差最大,而且差异一直很稳定,故选定为重点研究对象。通过HiTAIL-PCR扩增出这5个胞外多糖缺失突变株的Tn5插入位点,同时采用重测序的方法鉴定这些插入位点与通过HiTAIL-PCR所扩增出的插入位点是否一致,结果表明两种方法鉴定的位点一致。这些位点包含了糖基转移酶、琥珀酰合成酶、焦磷酸合成酶等相关功能基因,其中BJ25号缺失突变株的插入位点为blr2358且是单一插入位点,该基因的预测功能是糖基转移酶,已有针对Bradyrhizobium japonicum USDA110的全基因组测序表明该菌中有一个与胞外多糖合成相关的基因簇blr2358~blr2381,而本研究中筛选到的blr2358基因正是这个基因簇的第一个基因,因此把该基因作为重点研究的基因。鉴定了胞外多糖缺失菌株BJ25的插入突变位点以后,构建了此缺失突变株的互补体,并针对野生型、缺失突变株BJ25、含空载的野生型以及与此缺失突变株对应的互补体做了各种生物学表型与功能实验,以探究blr2358基因可能参与的功能。比较了各个处理组的菌落大小和菌落饱满程度、结瘤实验中植株的株高和结瘤数,结果表明缺失突变株BJ25比野生型的菌落明显更小,结瘤实验显示接种了缺失突变株BJ25比接种了野生型的植株株高显著更低和结瘤数更少,但互补实验在菌落大小、株高和结瘤数方面均能恢复,结果初步明确了blr2358基因会参与胞外多糖的调控,并且影响结瘤。这一初步研究结果有助于更深入的研究,并为后续合理利用该慢生型大豆根瘤菌提供理论基础。
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