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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染猪引起的一种重大烈性传染病,给我国养猪业造成重大的经济损失,严重影响养猪业的发展。细胞20S蛋白酶体亚单位β5（Proteasome subunit beta 5,PSMB5）是细胞蛋白酶体关键的蛋白亚基,位于细胞蛋白酶体催化中心并主导其发挥蛋白水解的功能,可影响病毒在细胞中的增殖。目前关于PSMB5蛋白影响CSFV增殖的研究较少,本文旨在研究PSMB5蛋白对CSFV增殖的影响及其机制,为CSF的防控提供理论基础。为了研究CSFV与PSMB5蛋白的相互作用关系,本研究首先探究CSFV感染PK-15细胞对PSMB5蛋白表达的影响,将CSFV石门株感染PK-15细胞,分别运用q RT-PCR和Western blot试验检测细胞中PSMB5的m RNA与蛋白水平。结果显示,与未感染的细胞相比,CSFV感染的细胞中PSMB5的m RNA和蛋白水平均降低,表明CSFV感染抑制了细胞PSMB5蛋白的表达。为进一步研究PSMB5对CSFV增殖的影响,本研究将p3×Flag-PSMB5重组质粒转染3D4/2细胞以过表达PSMB5蛋白、将靶向PSMB5基因的si RNA-PSMB5转染3D4/2细胞以抑制PSMB5蛋白的表达,同时分别设立p3×Flag-CMV和si RNA-NC转染的对照组,转染后24 h再感染CSFV石门株,q RT-PCR检测CSFV基因拷贝数,间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）测定CSFV的TCID50。结果显示,与p3×Flag-CMV转染细胞对照相比,p3×Flag-PSMB5转染细胞的PSMB5蛋白水平升高、CSFV的基因拷贝数减少、CSFV的病毒滴度降低;与si RNA-NC转染细胞对照相比,si RNA-PSMB5转染细胞的PSMB5蛋白水平降低、CSFV的基因拷贝数增加、CSFV的病毒滴度升高。结果表明,过表达PSMB5蛋白可抑制CSFV的增殖,而PSMB5蛋白基因功能干扰则促进了CSFV的增殖。为进一步探讨PSMB5是否通过与CSFV NS3相互作用从而影响CSFV的增殖,本研究将p3×Flag-PSMB5与HA-NS3重组质粒共转染3D4/2细胞,转染后48 h用HA标签抗体、Flag标签抗体与对应的荧光二抗孵育细胞,通过激光共聚焦显微镜观察。结果显示,在p3×Flag-PSMB5与HA-NS3共转染的细胞浆中可以观察到特异性的橙黄色荧光。结果表明,PSMB5与NS3共定位于细胞浆中,两者可能存在互作关系。接着本研究将0μg、1μg、2μg的p3×Flag-PSMB5质粒分别与2μg的HA-NS3质粒共转染3D4/2细胞,检测PSMB5蛋白和NS3蛋白的表达情况。结果显示,随着p3×Flag-PSMB5质粒转染剂量的增加,NS3蛋白的表达量随之下降,表明细胞蛋白PSMB5可抑制CSFV NS3蛋白的表达。为研究PSMB5蛋白是否通过泛素-蛋白酶体途径降解NS3蛋白,本研究将HA-NS3质粒转染3D4/2细胞,转染后24 h用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,同时设立HA-NS3质粒转染并用DMSO处理的细胞对照组,通过免疫沉淀试验检测NS3蛋白是否被泛素化。结果显示,转染并用MG132处理的细胞能检测到泛素蛋白的表达,而用DMSO处理的转染细胞未见泛素蛋白的表达,表明CSFV NS3蛋白在3D4/2细胞中被泛素化。上述实验表明,细胞蛋白PSMB5对NS3蛋白的表达具有抑制作用,其作用与泛素-蛋白酶体途径对NS3蛋白的泛素化修饰和降解有关。为了初步研究JAK/STAT（Janus activated kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT）通路是否介导CSFV感染对PSMB5蛋白表达的调控,本研究在CSFV感染PK-15细胞后加入STAT3（Signal transducers and activators of transcription 3）抑制剂STATTIC,同时设立未处理的空白对照组与感染CSFV后未加入STATTIC的细胞对照组,感染后72 h检测细胞中PSMB5的蛋白水平。结果显示,感染CSFV后STATTIC处理组的PSMB5的蛋白水平高于未处理组,与空白对照组差异不显著,表明STATTIC抑制STAT3后减轻了CSFV对PSMB5的抑制。在γ-干扰素（Interferon-gamma,IFN-γ）、病毒入侵等因素的刺激下,部分PSMB5蛋白会被免疫蛋白酶体亚基LMP7替代,两者共同参与MHC-I类抗原递呈途径降解病毒蛋白的过程,加强MHC-I类抗原递呈效率。为了研究PSMB5与LMP7是否通过MHC-I类抗原递呈途径影响CSFV在细胞中的增殖,本研究分别采取q RT-PCR和Western blot检测CSFV感染3D4/2细胞中LMP7和MHC-I类抗原递呈途径转运相关分子（TAP1、TAP2、Tapasin）的m RNA和蛋白水平;通过Western blot分别检测转染p3×Flag-PSMB5、si RNA-PSMB5、p3×Flag-LMP7和si RNA-LMP7的3D4/2细胞中TAP1、TAP2、Tapasin的蛋白水平。结果显示,与空白细胞相比,CSFV感染的3D4/2细胞中LMP7、TAP1、TAP2和Tapasin的m RNA水平和蛋白水平均显著下降;与p3×Flag-CMV转染细胞对照相比,p3×Flag-PSMB5转染细胞和p3×Flag-LMP7转染细胞的TAP1、TAP2和Tapasin的蛋白水平均显著上升;与si RNA-NC转染细胞对照相比,si RNA-PSMB5转染细胞和si RNA-LMP7转染细胞的TAP1、TAP2和Tapasin的蛋白水平均显著下降。结果表明,CSFV感染抑制LMP7、TAP1、TAP2和Tapasin的表达;PSMB5和LMP7过表达均促进TAP1、TAP2、Tapasin的表达。接着本研究分别将p3×Flag-PSMB5与p3×Flag-LMP7转染3D4/2细胞,转染后24 h感染CSFV,继续孵育48 h,同时设立转染p3×Flag-CMV后感染CSFV的细胞对照与未进行处理的空白对照,通过Western blot检测TAP1、TAP2、Tapasin的蛋白水平。结果显示,与转染p3×Flag-CMV后感染CSFV的细胞相比,转染p3×Flag-PSMB5后感染CSFV和转染p3×Flag-LMP7后感染CSFV的细胞中TAP1、TAP2、Tapasin的蛋白水平显著升高,其中TAP1、TAP2蛋白水平高于空白对照,表明PSMB5与LMP7可恢复CSFV感染细胞中TAP1、TAP2和Tapasin的蛋白水平。综上所述,本文研究了PSMB5蛋白与CSFV感染的相互作用关系,为进一步揭示CSFV与宿主的互作及CSFV的感染机制提供科学依据。