流感是由流感病毒（Influenza virus）引起的一种急性呼吸道疾病。流感病毒传播能力强,宿主范围广,曾多次引起世界性大流行,给人类和动物健康造成严重威胁。禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的一种急性禽类传染病,该病毒通常不感染人,然而从1997年开始,AIV已经跨越种间屏障,陆续出现H5、H6、H7、H9和H10亚型AIV直接感染人的病例,其高致死率给人类健康带来新的挑战。然而,目前对于AIV如何利用宿主因子在哺乳动物细胞中高效复制的机制仍是未知。因此,研究AIV复制所依赖的宿主因子,能为探究AIV在人源细胞中复制机制以及寻找新的抗禽流感药物靶标提供科学依据。首先本研究利用CRISPR screening技术,筛选H7N9 AIV在人源细胞中复制所依赖的宿主因子。利用稳定表达Cas9蛋白的A549细胞系和靶向18543个基因的187536条sg RNA文库,构建包含全部敲除信息的A549混合细胞。然后用高剂量（10 MOI）H7N9 AIV感染细胞,筛选和富集存活的细胞,对富集的存活细胞进行高通量测序分析,鉴定出候选基因。存活的细胞说明该细胞中单个基因的敲除影响AIV高效复制,该基因即为AIV复制所必须的宿主因子。本研究共鉴定出134个禽流感在人源细胞中复制所必须的宿主因子（p<0.01为筛选条件）。评分较高的基因主要有IFNAR2、SBNO2、STAT1、PDCD10、IFNAR1、CAB39等,这些基因主要集中在天然免疫、细胞凋亡、转录调控等通路中,为研究AIV复制所依赖的宿主因子提供有效数据。前期的蛋白互作组学数据已经表明,宿主蛋白DDX5与AIV PB2蛋白存在直接或者间接的相互作用。首先利用Bi FC和Co-IP实验证实DDX5蛋白与AIV PB2、PB1和NP发生相互作用,通过激光共聚焦实验证实互作发生在细胞核内。分别利用si RNA干扰和CRISPR/Cas9基因敲除技术沉默或敲除内源性DDX5蛋白的表达,发现流感病毒的复制水平在36和48小时出现明显下降,说明DDX5促进AIV增殖。DDX5为RNA解旋酶蛋白,其主要参与RNA的加工和成熟等环节。干扰DDX5的蛋白表达,发现AIV的聚合酶活性和m RNA、c RNA的生成都受到影响,说明DDX5影响AIV的RNA转录和复制。在敲除的细胞系中观察到,AIV v RNP（Viral ribonucleoprotein）复合体的核输出受到影响,说明DDX5影响v RNP的核输出。因此,DDX5与AIV聚合酶互作,促进AIV聚合酶的活性,从而促进AIV RNA的转录和复制,进而影响RNP的核输出。所以,DDX5是AIV高效复制所依赖的宿主蛋白之一。线性泛素连接酶蛋白HOIP在细胞内与HOIL-1L、SHARPIN蛋白组成线性泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）,该复合体在NF-κB的激活以及抗细胞凋亡通路中发挥着重要的功能。通过Bi FC和Co-IP实验证实HOIP蛋白能够与AIV PB2蛋白以及PB1蛋白发生相互作用,该相互作用主要发生在细胞质中。过表达HOIP蛋白及其组成的泛素连接酶复合体LUBAC能够促进NF-κB的激活,而同时过表达AIV聚合酶蛋白能够下调LUBAC引起的NF-κB的激活。通过si RNA干扰和CRISPR/Cas9敲除HOIP基因都能下调NF-κB的激活。说明AIV聚合酶蛋白通过与HOIP蛋白相互作用,下调NF-κB的激活。另外,过表达PB2和聚合酶复合体能够促进细胞TNFα和TRAIL引起的细胞凋亡,说明AIV聚合酶通过与HOIP蛋白相互作用促进细胞凋亡。进一步验证表明细胞凋亡的增加促进了v RNP的出核和包装成子代病毒,进而促进流感病毒复制。因此可以推断,AIV通过聚合酶蛋白,尤其是PB2和PB1蛋白与HOIP蛋白发生相互作用,下调NF-κB的活性,促进细胞凋亡,从而改变细胞通透性,有利于子代病毒的产生,使AIV能够更好的在人源细胞中复制。