癌症已成为严重威胁人类生命健康的头号杀手,全球新发癌症患者逐年增加,据有关数据显示目前位居全球癌症之首的是肺癌,其次是胃癌和乳腺癌等。癌症已经严重影响人们的生命和生活质量,发生率和死亡率都在逐年增加,如何预防和治疗癌症已成为肿瘤学领域面临的头号难题。胃癌(Gastric cancer,GC)是一类发生在胃上皮组织的全世界以及我国常见的位居首位的消化道恶性肿瘤,在所有恶性肿瘤中排第二位。近几十年来,全世界胃癌的发生发展虽然有明显的下降趋势,但其在中国的死亡率依然位居各种肿瘤的第一位。根据2017年来自国家癌症中心发布的《中国胃癌流行病学现状》报告显示,全世界2012年胃癌的新发病例共计95.1万,死亡病例共计72.3万,而中国胃癌的发生率和死亡率均约占全世界胃癌的发生率和死亡率的50%。目前,胃癌的临床治疗方法主要包括一般治疗、手术治疗、放射治疗、化学治疗和免疫治疗等,顺铂介导的化学治疗联合手术治疗和/或放射治疗取得了较好的疗效和预后,临床上常用顺铂联合氟尿嘧啶或卡培他滨作为胃癌化疗的标准治疗方案。顺铂是第一个被发现的具有细胞周期非特异性和抗癌活性的金属配合物药物,其可通过抑制癌细胞DNA复制,进而损害癌细胞胞膜结构而达到广谱抗癌作用。近年来,顺铂在临床上被广泛地用于多种恶性肿瘤的治疗,如胃癌,卵巢癌,睾丸癌和肺癌等等。其中,在胃癌的化疗治疗过程中,常联合氟尿嘧啶或卡培他滨作为一线药物被广泛地应用。体外实验揭示,顺铂处理不同株系胃癌细胞后,均会伴随基因和蛋白质水平发生明显的变化,进而调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移&侵袭等功能,以达到杀死肿瘤细胞的目的,并以期获得顺铂治疗胃癌的潜在靶点。然而,随着高通量技术的快速发展,规模化研究顺铂处理胃癌细胞后小RNA表达水平的变化尚未见报道,特别是差异miRNAs表达谱的变化。因此,顺铂处理胃癌细胞后差异miRNAs表达谱亟待揭示,并以期开发顺铂治疗胃癌的联合小分子新靶点,为胃癌的临床治疗提供重要的新干预方法。基于此,本研究拟开展的具体工作如下:目的基于小RNA高通量测序技术研究顺铂处理胃癌细胞NCI-N87后差异miRNAs表达谱变化,并结合双荧光素酶报告基因系统和细胞功能实验研究差异表达miRNAs潜在调控靶点,进而揭示其潜在的作用机理。方法首先采用梯度浓度顺铂处理人源胃癌细胞NCI-N87,采集细胞图片并结合MTT法测定细胞增殖活性以筛选获得顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的最佳顺铂浓度。其次,基于上述筛选的最佳顺铂浓度处理胃癌细胞,收集细胞后进行小RNA高通量测序及生物信息学分析获得差异表达miRNAs,并进行热图和火山图分析。基于上述差异miRNAs表达谱筛选5个显著上调miRNAs和5个显著下调miRNAs进行实时荧光定量PCR验证。针对验证与高通量测序一直的miRNAs采用TargetScan和miRDB靶基因预测软件进行靶基因预测,并利用R语言包绘制Venn图,针对上述两个软件获得的交叉靶基因进行GO和KEGG聚类分析,并利用Cytoscape软件进行交叉调控网络构建。针对miRNAs调控的靶基因筛选获得靶基因的3′-UTR区,构建双荧光素酶报告基因载体,测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性,取二者比值获得miNRAs调控靶基因的体外活性。体外合成双荧光素酶报告基因系统验证的miRNAs模拟物Mimic和抑制子Inhibitor,转染顺铂处理的胃癌细胞NCI-N87,分别采用MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞周期和细胞凋亡,Transwell小室测定细胞迁移&侵袭。结果1)当顺铂浓度达到15μg/ml时,对胃癌细胞NCI-N87的损伤已接近50%。从采集的细胞图片看,在此浓度下对胃癌细胞NCI-N87造成一定的损伤,但仍有50%以上的细胞状态较好。因此,后续确定顺铂致胃癌细胞NCI-N87损伤的最佳浓度为:15μg/ml。2)与对照组相比,顺铂处理后,胃癌细胞NCI-N87中共获得49个显著差异表达miRNAs,包括33个显著上调miRNAs和16个显著下调miRNAs。3)与对照组相比,顺铂处理后hsa-miR-1246的表达水平显著上调,hsa-miR-892b的表达水平显著下调。4)基于TargetScan和miRDB数据库靶基因预测分析发现,hsa-miR-1246在两个数据库中的交叉调控基因共计196个,hsa-miR-892b在两个数据库中的交叉调控基因共计323个。进一步地,根据交叉调控基因进行GO功能聚类和KEGG信号通路聚类分析发现,hsa-miR-1246调控的靶基因共参与30个包含生物过程、细胞组成和分子功能的过程和3个KEGG信号通路,hsa-miR-892b调控的靶基因共参与29个包含生物过程、细胞组成和分子功能的过程和11个KEGG信号通路,二者均具有复杂的交叉调控网络。5)共转染hsa-miR-1246的模拟物Mimic及其靶基因ATP2B2 3′-UTR区的野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒载体,与NC组和Mut+Mimic组相比,WT+Mimic组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值没有变化,说明hsa-miR-1246对靶基因ATP2B2 3′-UTR区没有调控活性。同样地,共转染hsa-miR-892b的模拟物Mimic及其靶基因IL1A 3′-UTR区的野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒载体,与NC组和Mut+Mimic组相比,WT+Mimic组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值显著下降(**:p<0.01),说明hsa-miR-892b通过下调靶基因IL1A 3′-UTR区调控靶基因的活性。6)体外合成的hsa-miR-892b Inhibitor可协同抑制顺铂处理的胃癌细胞NCI-N87的增殖活性,可增加胃癌细胞NCI-N87的G0/G1期,抑制胃癌细胞NCI-N87的S期,可协同增加顺铂处理的胃癌细胞NCI-N87的凋亡水平和迁移&侵袭能力。7)体外合成的hsa-miR-892b Mimic处理胃癌细胞NCI-N87后,与Cisplatin和Cisplatin+Inhibitor组相比,其靶基因IL1a蛋白和mRNA的表达水平显著降低,且具有统计学意义。结论本研究基于小RNA高通量测序技术获得了顺铂处理胃癌细胞的差异miRNAs表达谱,结合双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-892b对其靶基因IL1A具有调控活性。细胞功能实验说明hsa-miR-892b对胃癌细胞NCI-N87具有潜在的调控活性,可协同顺铂共同作用于肿瘤细胞,具有潜在的临床开发应用前景。