背景川崎病（Kawasaki disease,KD）是一种急性、自限性的全身血管炎性疾病,病变主要累及中小动脉,尤其是冠状动脉,是成年后冠心病的高危因素。MicroRNAs（miRNAs）是近年来研究的热点,调控着人类近三分之一基因的功能,参与了细胞的增殖、分化、凋亡和代谢等重要生物学过程。本研究首先通过川崎病患儿外周血标本单个核细胞中miRNA-223-3p（miR-223-3p）表达量的检测,验证之前基因芯片的预测结果:其在川崎病组织中表达显著上调。继而拟通过体内外研究进一步探讨miR-223-3p在川崎病发病过程中的功能,阐明miR-223-3p可通过调控白介素-6/白介素-6受体β亚单位-信号传导及转录激活因子3（IL-6/IL6ST-STAT3）信号通路影响血管内皮损伤的具体作用机制,为川崎病的临床诊断与治疗提供可靠的靶标。第一部分MiRNA-223-3p在川崎病患儿外周血单个核细胞中的表达及其与冠状动脉损伤的关系目的:分析不同组别川崎病患儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中 miR-223-3p、白介素-6（IL-6）受体 β亚单位信使核糖核酸（IL6STmRNA）、血清中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间粘附因子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的相对表达量,探讨miR-223-3p与川崎病发生与分型的关系,为防治川崎病冠状动脉损伤提供新的思路。方法:选取川崎病住院患儿作为实验组,依据超声心动图检测结果将其分为冠状动脉损伤组与无冠状动脉损伤组,依据病程将其分为急性期与亚急性期。选取同时期因发热住院行相关检查后诊断为病毒感染及儿童保健门诊行定期体格检查的健康婴幼儿作为对照组。运用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）方法检测各组患儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中 miR-223-3p、白介素-6细胞因子受体（IL6ST）mRNA的相对表达量,酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清IL-6、TNF-α、ICAM-1的表达量,验证miR-223-3p与川崎病发生、分型及冠状动脉损伤的关系。结果:（1）有冠状动脉损伤（CAL组）及无冠状动脉损伤组（nCAL组）川崎病患儿急性期外周血单个核细胞中miR-223-3p的表达量均显著高于正常对照组及发热对照组（P<0.01）;且nCAL组miR-223-3p的表达量较CAL组更高（P<0.05）;而KD亚急性期miR-223-3p的表达量CAL组及nCAL组均较急性期明显减少（P<0.01）,且较发热对照组及正常对照组无统计学差异（P>0.05）。（2）川崎病CAL组及nCAL组急性期外周血单个核细胞中IL6STmRNA的表达量显著低于发热对照组及正常对照组（P<0.01）;且CAL组IL6STmRNA的表达量较nCAL组更低（P<0.05）;而KD亚急性期IL6STmRNA的表达量CAL组及nCAL组均较急性期升高（P<0.05）,且较发热对照组及正常对照组无统计学差异（P>0.05）。（3）川崎病患儿急性期外周血单个核细胞中miR-223-3p表达量与IL6STmRNA的表达量呈负相关（r2=0.6803,p<0.0001）。（4）血清ELISA检测发现急性期川崎病组IL-6水平显著高于发热对照组及正常对照组（P<0.01）;并且CAL组中IL-6水平显著高于nCAL组（P<0.01）;亚急性期川崎病组的血清IL-6水平显著降低,并且与对照组无统计学差异（P>0.05）。KD组急性期血清ICAM-1水平明显高于发热对照组及正常对照组（P<0.01）;川崎病CAL组ICAM-1水平高于nCAL组（P<0.05）;KD组亚急性期血清ICAM-1水平有所下降,但仍高于发热对照组及正常对照组中ICAM-1的水平（P<0.05）。（5）川崎病组急性期血清TNF-α水平显著高于发热对照组及正常对照组（P<0.01）;川崎病CAL组中TNF-α水平明显高于nCAL组（P<0.01）;川崎病亚急性期血清中TNF-α水平相对于急性期明显减少（P<0.01）,与正常对照组无统计学差异（P>0.05）。结论:MiR-223-3p在本次小样本临床实验的川崎病患儿急性期及非冠状动脉损伤组外周血单个核细胞中明显高表达,提示其与川崎病的发生及分型密切相关;IL6STmRNA在川崎病急性期及非冠状动脉损伤组中明显低表达,且miR-223-3p的表达量与IL6STmRNA水平呈负相关,提示川崎病中二者可能存在着某种调控关系。我们由此推测miR-223-3p可能参与了其急性期的免疫炎症反应,借助相关炎症因子的调节和信号通路的调控作用,进而降低血清中ICAM-1的表达水平,并调控TNF-α的表达,减轻血管内皮损伤。miR-223-3p可能成为未来川崎病治疗的新靶标。第二部分川崎病小鼠模型中miRNA-223-3p可经IL-6/IL6ST-STAT3信号通路调控血管内皮细胞损伤的相关研究目的:验证川崎病小鼠血管损伤模型创建成功。检测不同时间点小鼠外周血单个核细胞中miR-223-3p、IL6STmRNA的相对表达量;小鼠主动脉、冠状动脉标本中STAT3mRNA、E-selectin、ICAM-1的相对表达量;外周血血清中TNF-α、IL-6的蛋白水平。探讨miR-223-3p与川崎病小鼠冠状动脉损伤的关系,为应用miR-223-3p激动剂治疗川崎病冠状动脉损伤提供参考依据。方法:首先利用不同浓度的白色念珠菌水溶物（candida albicans water-soluble fraction,CAWS）腹腔注射构建川崎病小鼠冠状动脉损伤模型,行心脏及冠状动脉标本HE染色病理学检查及透射电镜检查验证川崎病小鼠模型创建成功。然后采用随机数字表法将小鼠分为三组KD组、miR-223-3p组及对照组。KD组与miR-223-3P组均于实验的第1-5天上午8点起准时依次腹腔注射CAWS 8mg（0.1ml）/只,miR-223-3P组于实验的第五天同时行尾静脉注射miR-223-3P激动剂（1mg/kg/只）,对照组则依次予同等体积（0.1ml）的生理盐水行腹腔注射。于末次注射后的第1d、3d、5d、7d、10d的上午8点起,每组分别随机取6只小鼠采用摘眼球法留取外周血标本,之后立即行颈椎脱臼法处死,继而留取心脏冠状动脉及主动脉标本。RT-qPCR法检测各组小鼠不同时期外周血单个核细胞中miR-223-3p、IL6STmRNA的相对表达量,主动脉、冠状动脉标本中信号转导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription,STAT3）mRNA、E-选择素（E-selectin）、ICAM-1的相对表达量,ELISA法测定小鼠不同时期血清中炎症因子TNF-α、IL-6 水平。结果:（1）8mg（0.1ml）组CAWS腹腔注射致各时间点小鼠免疫性血管炎病理损伤的HE染色及电镜图片均符合人川崎病血管炎病理学改变。（2）KD组及miR-223-3p组小鼠外周血单个核细胞中miR-223-3p的相对表达量在病程初期较对照组均逐渐升高,第3天达高峰,差异有统计学意义（P<0.05）;且miR-223-3p组的表达量显著高于KD组（P<0.05）;之后两组小鼠外周血单个核细胞中miR-223-3p表达量均逐渐下降,第7天起渐恢复至对照组水平（P>0.05）。（3）KD组及miR-223-3p组小鼠外周血单个核细胞中IL6STmRNA的相对表达量在病程初期较对照组逐渐下降,第3天达低谷,差异有统计学意义（P<0.05）;且miR-223-3p组的表达量显著低于KD组（P<0.05）;之后两组小鼠外周血单个核细胞中IL6STmRNA表达量均逐渐上升,第7天起接近至对照组水平（P>0.05）。（4）KD组及miR-223-3p组小鼠主动脉、冠状动脉标本中STAT3mRNA的相对表达量在病程初期较对照组逐渐下降,第5天达低谷,差异有统计学意义（P<0.05）;且miR-223-3p组的表达量显著低于KD组（P<0.05）;之后两组小鼠中STAT3mRNA表达量逐渐上升,第10天起渐接近至对照组水平（P>0.05）。（5）KD组与miR-223-3p组小鼠主动脉、冠状动脉标本中E-selectin、ICAM-1水平较对照组渐升高,第5天达高峰,差异有统计学意义（P<0.05）,之后第七天起两组E-selectin、ICAM-1水平均逐渐下降,且miR-223-3p组与KD组无明显差异,但仍高于对照组（P<0.05）。（6）与对照组相比,miR-223-3p组小鼠外周血清中的TNF-α、IL-6水平逐渐升高,在第3天达到最高值,之后逐渐降低,直至接近对照组水平。而KD组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平保持持续升高,至第7天才达到最高值,并且与对照组相比具有显著差异（P<0.01）,之后第10天逐渐降低至接近对照组水平（P>0.05）。结论:8mg（0.1ml）CAWS腹腔注射致川崎病小鼠血管损伤模型可成功模拟人川崎病病理改变,最终确定为小鼠KD模型实验的适宜浓度。川崎病小鼠动物模型实验研究表明:miR-223-3p的表达趋势与IL6ST mRNA、STAT3 mRNA的水平变化趋势相反,miR-223-3p表达峰值过后E-selectin和ICAM-1的表达才开始升高。推测:miR-223-3p可能通过调控IL-6/IL6ST-STAT3信号通路继而对血管内皮细胞损伤起保护作用。第三部分冠状动脉内皮细胞损伤模型中miRNA-223-3p可经IL-6/IL6ST-STAT3信号通路调控血管内皮细胞损伤的研究目的:荧光素酶报告实验验证miR-223-3p与IL6ST的靶向关系;采用不同浓度及不同作用时间的肿瘤坏死因子-α刺激以建立适宜的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）损伤模型;验证KD组急性期血浆是否可刺激PBMC分泌miR-223-3p;然后分别用miR-223-3p过表达和敲减慢病毒处理HCAECs损伤模型,验证HCAECs损伤模型中miR-223-3p可经IL-6/IL6ST-STAT3信号通路在调控血管内皮细胞损伤中起保护作用。方法:运用荧光素酶报告实验的方法,对比检测两组:3’ UTR+miRNA{表达目的microRNA（hsa-mir-223）的载体质粒}与3’ UTR-NC（3’ UTR空载质粒,作为靶基因3’UTR质粒阴性对照）+miRNA的萤火虫荧光酶荧光值及海肾荧光酶荧光值,验证miR-223-3p可以与IL6ST的3’UTR结合;运用倒置相差显微镜观察24 h不同浓度TNF-α作用下人冠状动脉内皮细胞的形态变化;CCK-8法检测不同浓度的TNF-α刺激作用下各组的相对吸光度（代表不同浓度TNF-α对内皮细胞活性的影响）;同时检测同一浓度TNF-α刺激作用下不同时间点内皮细胞的相对活力,最终确定TNF-α引起人冠状动脉损害的适宜浓度和适宜作用时间;将川崎病组急性期血浆2ml及健康对照组血浆2ml分别与外周血单个核细胞共培养48小时,之后检测两组标本外周血单个核细胞中miR-223-3p的相对表达量;下一步先验证miRNA223慢病毒感染对miR-223-3p表达的影响;继而分别用miR223-3p过表达慢病毒及其阴性对照组病毒、miR223-3p敲减慢病毒及其阴性对照组病毒、空细胞病毒感染HCAEC,同时联合40 ng/ml的TNF-α或磷酸盐缓冲液（PBS）刺激细胞,Western blot检测不同组HCAECs中IL6ST的蛋白表达,ELISA法检测各组上清液中IL-6、E-selectin和ICAM-1的含量。最后将细胞实验分为四组:TNF-α组（40 ng/mL的TNF-α处理6小时）,miR-223-3p激动剂组（40 ng/mL的TNF-α处理6小时的同时,加用miR-223-3p过表达慢病毒来感染HCAECs）,miR-223-3p抑制剂组（40 ng/ml的TNF-α处理6小时的同时,加用miR-223-3p敲减慢病毒感染HCAECs）,NC组:PBS作用HCAECs 6小时;WES（全自动蛋白质印迹定量分析系统）检测HCAECs 中 p-STAT3/STAT3 和核因子 κB（nuclear factor kappa-B）p65 蛋白的表达水平。结果:（1）荧光素酶报告实验结果提示:miR-223-3p可以与IL6ST的3’UTR端结合,抑制IL-6ST的表达。（2）倒置相差显微镜观察发现:对照组人冠状动脉内皮细胞形态正常,随着TNF-α的加入及浓度的不断升高,HCAECs耐受性逐渐减低,可表现为细胞收缩,出现畸形细胞,细胞间隔增大,贴壁松散（TNF-α 40 ng/ml处理24小时组）,上清中出现较多崩解坏死的细胞碎片（TNF-α 80ng/ml处理24小时组）。（3）CCK-8实验检测结果提示:40 ng/ml的TNF-α处理24 h时可以显著降低内皮细胞的活性（CCK-8值明显下降）,再升高TNF-α的浓度,CCK-8值变化不大。（4）CCK-8实验检测结果提示:40 ng/ml的TNF-α处理6小时时内皮细胞活性无明显下降,之后随着处理时间的延长,内皮细胞的相对活力明显下降。故我们选择40 ng/ml作用6小时作为进一步细胞实验时TNF-α的适宜作用浓度及时间。（5）与健康对照组相比,川崎病组急性期血浆与外周血单个核细胞共培养48小时后外周血单个核细胞中miR-223-3p的相对表达量明显升高（P<0.01）。（6）较miR-223-3p过表达慢病毒的阴性对照组而言,miR-223-3p过表达慢病毒组可显著提高TNF-α刺激HCAECs后上清液中miR-223-3p的表达水平（P<0.01）;较miR-223-3p敲减慢病毒的阴性对照组而言,miR-223-3p敲减慢病毒组则可显著降低TNF-α刺激HCAECs后上清液中miR-223-3p的表达水平（P<0.05）。（7）较miR-223-3p过表达慢病毒的阴性对照组而言,miR-223-3p过表达组可显著降低TNF-α刺激HCAECs中IL6ST的蛋白表达水平（P<0.05）;较miR-223-3p敲减慢病毒的阴性对照组而言,miR-223-3p敲减慢病毒组则可显著升高TNF-α刺激HCAECs中IL6ST的蛋白表达水平（P<0.01）;（8）在TNF-α组、miR-223-3p过表达慢病毒组、敲减慢病毒组这三组标本中,上清液中IL-6水平无明显差异（P>0.05）。miR-223-3p过表达慢病毒组HCAECs中E-selectin 和 ICAM-1 水平较 TNF-α 组明显偏低（P<0.01）;而 miR-223-3p 敲减慢病毒组HCAECs中E-selectin和ICAM-1水平与TNF-α组比较无显著差异（P>0.05）。（9）较TNF-α组而言,miR-223-3p激动组可显著下调HCAECs中p-STAT3/STAT3和NF-κB p65蛋白的表达水平（P<0.01）;而miR-223-3p抑制组则可显著上调HCAECs中p-STAT3/STAT3和NF-κB p65蛋白的相对表达量（P<0.05）。结论:荧光素酶报告实验证实:miR-223-3p可以与靶基因IL-6ST的3’UTR区特异性结合,抑制IL6ST的表达。miR-223-3p的表达与IL6ST、p-STAT3/STAT3、NF-κB p65的水平密切相关,miR-223-3p可通过调控IL-6/IL6ST-STAT3信号通路,进而调控冠状动脉内皮细胞表面E-selectin、ICAM-1的表达,减轻血管内皮损伤。miR-223-3是川崎病血管内皮损伤的重要调节因子,可能成为未来川崎病治疗的潜在靶标。