【摘 要】
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作为体外展示技术,核糖体展示技术是用于从大容量文库中快速筛选功能性和特异性蛋白分子的强有力工具。与其他展示技术相比,核糖体展示技术有其独特的优势。该技术的应用领域
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作为体外展示技术,核糖体展示技术是用于从大容量文库中快速筛选功能性和特异性蛋白分子的强有力工具。与其他展示技术相比,核糖体展示技术有其独特的优势。该技术的应用领域广泛,包括抗体工程、蛋白质组学、诊断学和治疗学。对高亲和力的功能蛋白的快速筛选和定向进化是核糖体展示技术最广泛的应用,特别是对抗体的筛选和进化。本研究以新疆双峰驼外周血为原材料,构建了核糖体展示天然纳米抗体文库,有效库容达到2.38×1014。以pET-30a为表达载体,通过包涵体变复性的方法成功获得了具有生物活性的HIF-1α-PAS-B重组蛋白。利用核糖体展示技术,以HIF-1α-PAS-B重组蛋白作为抗原,经过四轮筛选成功获得了亲和力较高的VHH-67和VHH-212。继而,VHH-67和VHH-212分别在大肠杆菌的周质空间和细胞质中实现表达。热稳定性分析结果显示,VHH-67的Tm值为76.60℃,VHH-212的Tm值为79.55℃。荧光倒置显微镜观察结果和Western Blot结果均可说明VHH-212在胰腺导管腺癌细胞系中实现表达。RT-qPCR实验结果显示,VHH-212在胞内结合了HIF-1α蛋白,一定程度上抑制了HIF-1α转录激活下游靶基因的功能。MTT比色法实验证明了纳米抗体不会对细胞产生毒性。为了获得特异性针对HIF-1α的纳米抗体,本课题构建了大容量核糖体展示天然纳米抗体文库,制备了具有筛选质量的HIF-1α-PAS-B作为抗原,并对筛选出的纳米抗体进行了评价,以期为新药的研发、疾病的诊断与治疗做出贡献。
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