氨基糖甙类是一种主要抗需氧的革兰阴性细菌的一种光谱的抗生素,包括大肠杆菌和假单胞菌,在发展中国家由于其廉价、低过敏、耐药少而仍然在临床上用于肺结核、肺囊性纤维化、小儿脓毒症等疾病的治疗。永久性不可逆的听力下降、前庭功能损害及肾脏损伤是其主要的副作用。其中耳毒性是限制其临床应用的主要原因。新霉素作为氨基糖甙类中的一种,具有毒性最大且仅有耳毒性且较少引起前庭毒性的特性。临床上主要用于肝性脑病和高胆固醇血症的辅助治疗。氧化应激引起的凋亡是目前已证明氨基糖甙类抗生素耳毒性的主要机制。自噬是近些年来广受关注的一种细胞应激反应,是一种高度保守的蛋白降解途径,是细胞应对各种恶劣环境的生存机制,几乎发生在所有的细胞中,在内耳中,自噬作用已被报道在小鼠耳石发育、鸡听泡的早期发育和快速老化小鼠听力损失中起重要作用。然而,在正常出生后和成年内耳的自噬机制没有研究。自噬和氧化应激及凋亡均有密切的联系,因此我们推测自噬可能参与氨基糖甙类抗生素耳毒性的发生,并可能产生积极的保护作用,且与药物作用浓度及时间有重要的相关性。本实验目的是通过新霉素损伤C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜和HEI-OC1听细胞株建立耳毒性模型,实验分为正常对照组和新霉素损伤组,经western-blot检测自噬相关蛋白LC3,透射电镜观察自噬体及自噬溶酶体,耳蜗全息铺片+免疫荧光染色检测LC3蛋白的表达,转染带荧光的LC3质粒等技术多层面检测自噬的发生,以及不同新霉素浓度及时间作用下观察自噬和凋亡的关系。应用自噬激活剂Rapamycin上调自噬,采用全耳蜗毛细胞计数方法、CCK8实验、PI-Annexin V细胞凋亡双染流式检测方法观察毛细胞存活情况及凋亡的变化情况。结果表明在组织和细胞水平双重验证了耳毒性模型中存在明显的自噬发生及发展过程。自噬的水平与新霉素的浓度和作用时间有明显相关,低浓度的新霉素损伤会出现大量的自噬,此时激活自噬会保护毛细胞损伤,减少毛细胞的凋亡,而高浓度的新霉素损伤会引起大量的氧化应激,进而导致毛细胞大量凋亡,此时自噬作用甚微。因此证明了在感觉毛细胞中自噬和凋亡的关系,表明自噬是一种细胞的内在过程,自噬可以减轻凋亡,从而减少毛细胞损伤,为临床防治氨基糖甙类药物性聋及干预的时机提供理论基础。