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第一部分建立延期直接神经修复的大鼠模型目的建立标准化的大鼠坐骨神经延期修复模型,并验证二期直接缝合神经的可能性。方法Lewis雌性大鼠58只,随机分为6组,分别为及时修复(B0组,n=8)、延期1周(B1组,n=11)、4周(B2组,n=10)、6周(B3组,n=11)、8周(B4组,n=11)、12周(B5组,n=7)修复组。切断左侧坐骨神经,神经近断端反折后包埋于附近股肌内,远断端通过两根9/0Ethilon尼龙线牵拉固定于闭孔肌腱上以防止神经断端回缩。经过旷置不同时间后,用10/0Ethilon尼龙线直接缝合坐骨神经断端。若神经断端之间相距距离不大于4mm,且最大幅度反复活动左下肢后10/0Ethilon线仍牢固固定,则定义这种直接修复下的神经吻合口处无张力。二期修复神经手术过程中测量神经断端大小、相距距离、疤痕和神经瘤大小等术中参数,获取这些模型的参数后可以确保模型的标准化和可重复性。术后4周、8周、12周分别行神经电生理学检测,以证实无张力缝合的神经成功再生。结果延期1周、4周、6周、8周及12周神经修复组中,神经断端之间相距距离为0-9mm不等,均值分别为1.36、2.85、3.43、3.83及6.40mm；所有延期神经修复的50只大鼠中,39只到达无张力缝合标准,无张力缝合的成功率为78%。术后4周时,所有组均未测到复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, CMAP)。术后12周时,延期1周、4周组与及时修复组之间的CMAP恢复无统计学差异,但均显著优于延期6周、8周、12周组(P<0.05)。结论一种创新的、标准化的、可重复的大鼠坐骨神经延期修复模型己建立,且二期手术中神经可直接缝合,无张力神经直接缝合的成功率达78%。要获得效果有别于及时修复的延期神经修复模型,自神经切断至二期神经修复之间的时间间隔至少需4周。延期间隔时间越久,神经恢复越差。具体延期时间间隔的选择,需根据不同实验目的订制。[关键词]周围神经延期修复动物模型直接修复大鼠第二部分大鼠坐骨神经损伤后靶肌微环境变化规律及其时间过程的实验研究目的在大鼠坐骨神经损伤后不同时间,检测靶肌内各种微环境变化的特点和规律,了解这些变化的时间过程。方法Lewis成年雌性大鼠40只,体重200±5g,随机分为以下5组：切断左侧坐骨神经,旷置1周(A1组,n=8)、4周(A2组,n=8)、6周(A3组,n=8)、8周(A4组,n=8)及12周(A5组,n=8)。术后检测大鼠靶肌内微环境：电生理学(纤颤电位)、病理组织学(肌湿重,肌横截面积和纤维化程度,肌纤维表型)和分子生物学(MRF4、Myogenin、nAChR、MUSK、P21基因mRNA表达水平)。结果坐骨神经切断后3天就可在腓肠肌内侧头内记录到纤颤电位。最大纤颤电位波幅在神经损伤后1至4周达到峰值,6周起迅速降低,最后维持在较低水平；腓肠肌、比目鱼肌及胫前肌肌湿重维持率(患侧/健侧)随肌萎过程不断减小,术后4周时迅速减小为40%左右,术后8周和12周基本稳定在20%左右；胫前肌和腓肠肌内侧头肌横截面积随失神经时间不断减小,纤维化程度随失神经时间不断增大(P<0.05)；腓肠肌内侧头(混合肌)及胫前肌(快肌)的Ⅱ B型肌纤维(最快的快肌纤维)比例随失神经时间不断下降(P<0.05),Ⅰ型(慢肌纤维)和Ⅱ A型肌纤维(最慢的快肌纤维)比例则随失神经时间不断升高(P<0.05),但肌纤维总数不变,提示快肌纤维向较慢纤维转化。比目鱼肌(慢肌)的Ⅱ A型肌纤维比例随失神经时间不断升高,Ⅰ型肌纤维比例随失神经时间不断下降(P<0.05),但肌纤维总数不变,提示慢肌纤维向快肌纤维转化。术后4-6周是上述肌纤维表型发生变化最明显的时刻；失神经的腓肠肌内侧头中Myogenin、 MUSK、nAChR、P21及MRF4基因mRNA相对表达水平先增高后降低,失神经后4-6周时最高,之后不断下降并维持在较低水平。结论失神经靶肌的最大纤颤电位波幅、肌湿重、肌横截面积和纤维化程度、肌纤维表型、靶肌生长相关基因(Myogenin、MUSK、nAChR、P21及MRF4) mRNA相对表达水平均发生显著变化。上述靶肌内微环境变化与失神经时间密切相关,在失神经后4-6周时最明显。第三部分不同时间延期神经修复后靶器官恢复特点及预后相关指标的筛选目的比较不同时间延期神经修复的疗效,筛选出与预后密切相关的指标。方法清洁级Lewis成年雌性大鼠43只,切断左侧坐骨神经,旷置不同时间后直接缝合神经。随机分为以下6组：及时修复组(B0,n=8),延期1周(B1,n=8)、4周(B2,n=8)、6周(B3,n=8)、8周(B4,n=8)、12周修复组(B5,n=3)。术后每4周测量复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, CMAP)。继续饲养16周后取材,检测大鼠靶肌的电生理学(CMAP)、最大等长收缩肌力、神经肌肉病理组织学(肌湿重,肌横截面积和纤维化程度,肌纤维表型,有髓神经纤维计数)和分子生物学(Myogenin、MUSK、nAChR、P21及MRF4的mRNA相对表达水平)以了解神经肌肉功能恢复程度。通过分析上述神经肌肉功能恢复指标与失神经靶肌中微环境变化的相关性,筛选出与延期神经修复疗效密切相关的敏感指标。结果延期1周、4周修复组的电生理、肌湿重、最大等长收缩肌力、有髓神经纤维直径和密度、有髓轴索直径等与及时修复组相似,但均明显优于延期6周、8周及12周组(P<0.05)；及时修复组、延期1周修复组相比延期6-12周修复组,胫前肌和腓肠肌内侧头肌横截面积更大(P<0.05),胫前肌的纤维化程度更小(P<0.05)；腓肠肌内侧头内MRF4、Myogenin、nAChR、MUSK、P21基因mRNA相对表达水平在各不同延期修复组之间无统计学差异(P>0.05)；胫前肌、腓肠肌内侧头和比目鱼肌内各肌纤维表型的比例在各延期修复组中无统计学差异(P>0.05)；相关性分析发现失神经靶肌中最大纤颤电位波幅、肌横截面积和纤维化程度、靶肌内ⅡB和ⅡA型肌纤维比例、nAChR基因mRNA相对表达水平与神经修复后的功能恢复程度成线性相关(P<0.05)。结论不同时间延期神经修复的效果不同,延期时间越长,神经修复的效果越差；再生肌肉的肌湿重、CMAP波幅、最大等长收缩肌力和有髓鞘神经纤维总数、直径、密度、轴索直径等均是反映神经肌肉恢复程度的良好指标。及时修复、延期1周、4周修复组之间的神经肌肉功能恢复程度无统计学差异(P>0.05),但均明显优于延期6周、8周及12周组(P<0.05)。失神经靶肌中最大纤颤电位波幅、肌横截面积和纤维化程度、靶肌内ⅡB和ⅡA型肌纤维比例、靶肌内nAChR mRNA相对表达水平均是与神经修复疗效密切相关的敏感指标。