论文部分内容阅读
人磷酸二酯酶同工酶4(phosphodiesterase,PDE4)选择性水解cAMP,并分为PDE4A、4B、4C、4D四种亚型。参与炎症反应的单核细胞和中性粒细胞以表达PDE4B2为主。因此,相应的PDE4抑制剂可用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病等炎症相关疾病。磁珠固定化靶蛋白可快速筛选潜在抑制剂混合物,但需要低成本大量表达高活性靶蛋白。前期研究发现,PDE4B2在原核细胞可溶表达丰度低且纯化过程不稳定。有报道显示,现有PDE4B2抑制剂的毒副作用与人全长PDE4B2以咯利普兰(R-rolipram)表征的高亲和力结合构象相关,而治疗作用与以R-rolipram表征的活性位点低亲和力结合构象相关。因此,本论文通过不同融合表达方式对PDE4B2全长及152-528aa截短突变体进行克隆表达纯化及表征,以期获得大量可溶表达的高表观比活且处于以R-rolipram表征的低亲和力结合状态的PDE4B2融合蛋白。将人磷酸二酯酶4B2(hPDE4B2)全长和152-528aa截短突变体融合6His-SUMO在大肠杆菌重组表达,经Ni2+-NTA纯化获得hPDE4B2全长SF-h PDE4B2和截短突变体ST-hPDE4B2重组蛋白。用Western blot检测多肽成分;用偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定酶活性,表征其km和对模型化合物的抑制常数。结果显示,纯化后的st-hpde4b2纯度较sf-hpde4b2高,st-hpde4b2(0.03u·mg-1)表观比活性接近sf-hpde4b2(1.31u·mg-1)的40倍,活性收率超过100倍;此表达纯化方案总活性收率不高,且westernblot显示均有较多降解片段;测定(r)-rolipram和罂粟碱的抑制常数表明,sf-hpde4b2对(r)-rolipram主要为高亲和力结合构象,而st-hpde4b2主要为低亲和力结合构象。对代表化合物的抑制常数进行数学分析,发现其双对数模型具有单调相关性。因此,与sf-hpde4b2相比,st-hpde4b2用于初步筛选抗炎活性hpde4b2抑制剂可能更有优势。用同源重组的方法将hpde4b2全长和152-528aa截短突变体基因克隆到带有gst标签的载体pgex-6p-1上,表达后经gst亲和层析柱纯化分别获得n-端融合gst的人全长hpde4b2(gf-hpde4b2)和截短突变体(gt-hpde4b2)。然而,纯化后的gf-hpde4b2最大表观比活为0.01u·mg-1,gf-hpde4b2最大表观比活为0.05u·mg-1。gf-hpde4b2和gt-hpde4b2酶活性收率均较低。进一步探索双标签纯化方法,将hpde4b2的n-端和c端与mbp和6-his标签三种形式融合:n-mbp/6his-c、n-6his/mbp-c和n-6his-mbp/6his-c,分别获得mcf-hpde4b2/mct-hpde4b2(带n-mbp/6his-c)、mnf-hpde4b2/mnt-hpde4b2(带n-6his/mbp-c)、mf-hpde4b2/mt-hpde4b2(带n-6his-mbp/6his-c)六种融合蛋白基因质粒,表达后经ni2+-nta和mbp亲和层析纯化获得的全长hpde4b2表观比活性依次是:mcf-hpde4b2(1.11u·mg-1)>mf-hpde4b2(0.1U·mg-1)>MNF-hPDE4B2(0.01 U·mg-1);截短突变体表观比活性依次是:MCT-hPDE4B2(1.25 U·mg-1)>MNF-hPDE4B2(0.6 U·mg-1)>MF-hPDE4B2(0.3 U·mg-1);全长hPDE4B2和截短突变体重组蛋白的活性收率也显著高于前两种方案。鉴于测定PDE4活性筛选抑制剂对靶蛋白活性的要求,以MCF-h PDE4B2和MCT-hPDE4B2为靶蛋白在成本上显得更有优势。综上所述,本研究成功获得hPDE4B2全长和截短突变体与三种不同标签的融合表达重组蛋白:融合6His-SUMO标签的hPDE4B2截短突变体的活性收率效果较hPDE4B2全长好;融合GST标签活性收率效果均不理想;N端融合MBP标签C端融合6his标签的hPDE4B2全长和截短突变体融合表达及纯化方案的活性收率最好。因此,推荐高通量初筛潜在抗炎活性的PDE4抑制剂用MCT-hPDE4B2,确认潜在抗炎活性的PDE4抑制剂用MCF-hPDE4B2。