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胃癌是全球第四大最常见的恶性肿瘤,我国的发病率则明显高于全球平均水平。由于胃癌患者无特异性的早期症状,近一半的胃癌患者在被诊断时已经进展到晚期,预后较差。胃癌的发生发展涉及一系列癌基因的激活和抑癌基因的失活。筛查这些基因并研究其作用机制对于胃癌的早期诊断和治疗具有重要的价值。胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein-3, IGFBP3)是IGFBP家族的主要组成成分,主要通过和循环中的I型胰岛素样生长因子(IGF-I)结合而发挥作用。既往研究表明,IGFBP3在多种肿瘤中表达异常,主要影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程,对侵袭转移的报道则较少。同源盒基因D10(homeobox D10, HoxD10)可以编码转录因子,我们的既往研究发现HoxD10可以影响胃癌细胞的增殖、凋亡及迁移侵袭等行为。通过基因表达谱芯片筛选发现,在胃癌细胞中,包括IGFBP3在内的多个基因可能受到HoxD10的调节。因此,我们推测IGFBP3可能作为转录因子HoxD10的下游靶点,影响胃癌的生物学行为。为证实此推测,在本研究中,我们通过对胃癌组织芯片进行免疫组化检测,分析胃癌与癌旁IGFBP3蛋白表达水平的差异及IGFBP3表达同患者TNM分期和生存期等的相关性。通过划痕试验和Transwell试验,研究IGFBP3沉默表达后对胃癌细胞迁移侵袭的影响,并检测迁移侵袭相关因子寻找可能的机制。通过染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因检测,明确了HoxD10蛋白对IGFBP3的转录调控机制。研究方法1.胃癌组织中IGFBP3表达水平和临床资料的相关性分析(1)IGFBP3抗体对含有胃癌和癌旁配对组织的组织芯片进行免疫组化染色,分析癌与癌旁IGFBP3表达的差异。(2)分析胃癌组织中IGFBP3的表达和患者TNM分期、病理分级及生存期等的相关性。2. IGFBP3对胃癌细胞迁移侵袭的作用及可能的机制(1)采用划痕试验、Transwell迁移试验检测siRNA靶向干扰IGFBP3表达后,胃癌细胞BGC823和SGC7901迁移能力的变化。(2)铺基质胶的Transwell侵袭试验检测siRNA靶向干扰IGFBP3表达后,胃癌细胞BGC823和SGC7901侵袭能力的变化。(3) RT-PCR和Western blotting检测siRNA靶向干扰IGFBP3表达后,迁移侵袭相关因子表达水平的变化。3.胃癌细胞中HoxD10对IGFBP3的转录调控研究(1)采用RT-PCR, Western blotting和双荧光素酶报告基因检测系统,在胃癌细胞BGC823和SGC7901中,检测HoxD10过表达后,IGFBP3的mRNA.蛋白质及启动子转录活性的变化。(2)利用启动子结合位点预测软件PROMO预测IGFBP3启动子区域可能和转录因子HoxD10结合的位点,以此为基础设计引物,采用染色质免疫共沉淀检测能够募集HoxD10的位点。(3)采用双荧光素酶报告基因检测鉴定HoxD10的活性结合位点,对核心结合序列进行点突变后再次检测荧光素酶活性的变化是否被沉默。研究结果1.胃癌组织中IGFBP3表达水平和淋巴结转移和预后相关(1)胃癌组织中IGFBP3的表达显著低于配对的癌旁组织(p<0.01)。(2) IGFBP3高表达的患者处在高淋巴结分期N2+N3的比例显著低于IGFBP3低表达的患者(p<0.05),清扫出的总淋巴结中出现转移的比例亦显著较低(p<0.01)。(3)IGFBP3高表达患者4.5年的生存率显著高于IGFBP3低表达的患者(p<0.01)。2. IGFBP3抑制胃癌细胞的迁移侵袭(1)在不同野生胃细胞株中,HGC27表达IGFBP3相对最高,BGC823、SGC7901和GES-1表达次之,AGS、MKN28、MKN45、NCI-N87和MGC803则低表达。(2) siRNA干扰IGFBP3的表达后,BGC823和SGC7901划痕的愈合显著加快,12h和24h的迁移率明显提高(p<0.01)。(3) siRNA干扰IGFBP3的表达后,迁移到Transwell小室下层的细胞计数明显增加(p<0.01)。(4) siRNA干扰IGFBP3的表达后,穿过基质胶侵袭到Transwell小室下层的细胞明显增多,下层细胞洗脱后的OD值显著增加(p<0.01)。(5) siRNA干扰IGFBP3的表达后,MMP14,uPA和uPAR的mRNA表达量显著增加。1.胃癌细胞中HoxD10在转录水平调控IGFBP3的表达(1) pcDNA3.1-HoxD10转染的BGC823和SGC7901中HoxD10的mRNA和蛋白表达水平明显增高,同时伴随着IGFBP3的mRNA和蛋白表达水平的明显增高。(2)转染HoxD10后IGFBP3启动子报告基因荧光素酶活性显著增加(p<0.01)。PROMO软件预测显示IGFBP3转录上游2.3kb有5个可能和HoxD10结合的位点HBS1-5。(3)以HoxD10抗体沉淀的核酸为模板,HBS3、HBS4和HBS5引物可以扩增出明显条带；HoxD10过表达后,HBS3、HBS4或HBS5的报告基因荧光素酶相对活性均显著增加(p<0.01),突变的HBS3、HBS4和HBS5报告基因荧光素酶相对活性则无明显变化。研究结论1.胃癌组织中IGFBP3的表达和淋巴结转移负相关,IGFBP3表达高的患者生存期较长。2.IGFBP3能显著抑制胃癌细胞的迁移侵袭,其作用可能和MMP14, uPA/uPAR等因子相关。3.HoxD10可以同IGFBP3启动子区域的HBS3、HBS4及HBS5结合,在转录水平上调IGFBP3的表达。