禽白血病病毒J亚群和K亚群囊膜蛋白单克隆抗体的制备

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禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽反转录病毒家族的禽白血病病毒引起的一种鸡的传染性肿瘤疾病。禽白血病不仅造成病禽死亡,蛋鸡生产性能下降,还会产生免疫抑制,致使鸡群免疫应答能力降低,继发感染其它疾病。自禽白血病病毒J亚群发现以来,其宿主范围不断扩大,从最早的只感染肉鸡,蔓延到蛋鸡,扩大到地方鸡种,甚至有野鸭感染ALV-J的报道。目前几乎可感染所有品系的鸡种,给养禽业造成了巨大的经济损失。自2011年起,我国一些地方陆续分离到不同于已知的外源性禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)株,经鉴定发现其不属于ALV中的任一亚群,命名为K亚群。K亚群病毒的发现揭示了我国鸡群中禽白血病病毒感染的复杂性。目前尚无商品化疫苗可以预防此病,也无有效抗病毒药治疗该病,只有依靠净化种群,淘汰阳性鸡来控制ALV的传播。因此,针对亚群特异性单克隆抗体(Monoclonal Antibody,MAb)建立ALV抗原检测方法,实现临床上对疾病的快速诊断显得尤为重要。ALV包含三个结构基因,分别为gag基因,pol基因和env基因。env基因编码病毒囊膜蛋白,由gp85基因和gp37基因组成。gp37基因在ALV各亚群间高度保守,gp85基因在ALV各亚群间差异较大,也是ALV各亚群分类的基础。本研究分别针对ALV-J和ALV-K的gp85基因制备了禽白血病病毒J亚群和K亚群囊膜蛋白单克隆抗体。本研究首先将ALV-J和ALV-K的gp85基因分别构建到2种表达载体pET-28a和pGEX-6P-1上,然后进行原核表达及纯化,获得纯化蛋白后,分别建立了检测ALV-J和ALV-K抗体的间接ELISA方法。经过一系列对比试验确定ALV-J抗体间接ELISA检测方法的最佳包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液,抗原包被浓度为14μg/mL,封闭液选择5%脱脂乳,血清最佳稀释度为1:1000,酶标二抗最佳稀释度为1:2000,底物最佳作用时间为15min。采用建立的检测ALV-J抗体间接ELISA方法的最佳包被液,封闭液和底物最佳作用时间,确定检测ALV-K抗体间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为6.6μg/mL,血清最佳稀释度为1:2000。以带GST标签的J-gp85重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,以带HIS标签的J-gp85蛋白包被酶标板经间接ELISA方法筛选阳性细胞,避免了细胞融合后ELISA筛选实验过程中标签蛋白产生抗体造成的假阳性,经过5次细胞融合后筛选出1株能稳定分泌ALV-J-gp85蛋白的单克隆抗体,命名为JB7。以带HIS标签K-gp85重组蛋白免疫小鼠,以带GST标签的K-gp85蛋白包板,经过4次细胞融合筛选出2株能稳定分泌ALV-K抗体的MAb,命名为KD4和KE5。对制备的单抗JB7进行Western blot检测,表明该株单抗能特异性识别ALV-J-gp85蛋白。进行IFA验证,表明单抗能与ALV-J毒株发生特异性反应,不与ALV-A毒株和ALV-K毒株反应。对制备的单抗KD4和KE5进行Western blot检测,表明2株单抗都能特异性识别ALV-K-gp85蛋白。进行IFA验证,表明2株单抗都能与ALV-K毒株发生反应,此外,2株单抗还能识别ALV-A毒株。本次研究制备的ALV-J单克隆抗体为制备ALV-J国产化抗原诊断试剂盒奠定基础,研制的ALV-AK单克隆抗体对于ALV-K今后的研究是一个重要的补充,为今后ALV-AK抗原检测试剂盒的研制奠定了基础。
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