牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛、猪等动物的一种重要的传染病，临床主要表现为发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或畸形胎儿。世界每年死于BVDV感染的牛不少于500万头，占牛饲养总数的0.5％～1％。随着我国养牛业的迅速发展，国外品种不断引进，该病在我国发生、流行呈上升趋势。早在20世纪60年代，我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发生。目前，该病在河南也普遍存在。为找到一种快速诊断BVD的方法，有效地控制其蔓延，做好防制工作，减少BVD对河南省肉牛业造成的损失，本论文从以下几个方面进行了研究： 1、河南省牛病毒性腹泻流行病学调查 从河南省唐河、内乡等15个县市的不同牛群随即采集血样671份，从养牛业比较发达的南阳、周口、安阳3市部分规模化肉牛场随机采集645份血样，分别用牛病毒性腹泻抗体和抗原ELISA试剂盒检测，结果表明：671份血样中，154份为抗体阳性，阳性率为22.95％；645份血样中100份为BVDV阳性，其检出率为15.50％，从而证实BVD在河南省广泛存在。 2、河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 从河南省不同地区规模化肉牛场BVD疑似病例中采集病料，将处理好的病料接种MDBK细胞，并盲传四代，分离得到两株可产生细胞病变的病毒，经电镜观察、理化特性鉴定、琼脂扩散试验和中和试验，确定两株病毒均为BVDV，分别将其命名为HN-1株和HN-2株。动物回归试验进一步证实了所分离的两株病毒均为BVDV。 3、分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 在MDBK细胞上增殖BVDV HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，然后免疫BALB／c小鼠。应用单克隆抗体技术，制备脾细胞并与NS₀骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA筛选，用有限稀释法亚克隆，得到4株能分泌BVDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林：3A₈、3C₇、3C₁₁、3E₉。经鉴定，3A₈、3C₇、3E₉株分泌的单克隆抗林为IgG1亚类，3C₁₁，株为IgG2a亚类。杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A₈、3C₇、3C₁₁株分泌的抗体与CSFV，BDV发生交叉反应，与BCV、BRV无交叉反应，而3C₁₁株河南省肉牛规模化养殖场病毒性腹泻病的诊断与防制技术研究分泌的抗体与以上四种病毒均不发生交叉反应，显示出较好的特异性。这些单克隆杭体的获得为BVD的研究及诊断方法的建立莫定了基础. 4、牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体双夹心ELISA的建立及其应用 用3C:l株，按常规方法制备腹水、提纯IgG，与已制备的兔抗BVDV IgG建立了检测BvDv的单克隆杭体双夹心ELISA。该方法与病毒分离试验对比，阳性符合率为86.67%，阴性符合率为100%;与中和试验对比，阳性符合率为93.33%，阴性符合率为100%。该方法最低病毒检出量为20on留ml。用该方法与商品化EusA试剂盒同时对比检测牛全血100份，二者阳性检出符合率为96.巧%。初步应用该方法对河南省南阳、周口、安阳3市肉牛场的562头份牛全血的检测结果表明，牛群BVDV的感染率为1 7.08%。该方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性，能够较好地用于BVDV的监测，具有良好的应用前景。 5、牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 将BVDV HN一1株在MDBK细胞上增殖、浓缩、灭活，并与免疫增强剂一一囊素共同乳化研制出BVD囊素油乳剂苗。对其物理性状、安全性、保存期等进行检测，初步应用该疫苗进行免疫试验，并和常规灭活苗以及弱毒苗进行免疫效果比较。试验结果表明:该疫苗合格、安全，保存期达到12个月;产生的抗体水平较高且维持时间长，免疫效果和保护率优于常规灭活苗和弱毒苗. 6、肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 根据BvD流行病学特征，结合本研究成果，从品种选育、饲养管理、饲料营养、环境调控、免疫预防、兽医卫生等方面制定了一套BvD防制措施。并在河南的南阳、周口、安阳3市部分肉牛场进行了实施，实施效果表明:试验牛场BVD感染率、发病率、牛场整体病死率均有所下降，在一定程度上控制了该病的流行和传播，提高了肉牛的生产性能，取得了显著的经济效益和社会效益。关健词:牛病毒性腹泻;牛病毒性腹泻病毒;流行病学;分离鉴定;单克隆杭体;双杭夹心ELISA;囊素油乳剂苗;防制措施