【摘 要】
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在猪的疾病治疗机制中,猪肺泡巨噬细胞3D4/21作为一种先天性免疫细胞,通过分泌细胞因子发挥着非常重要的作用。近年来的研究表明,增强子作为一种顺式调控元件,通过显著提高基因的表达水平,调控细胞类型特异性基因的时空选择性表达,在免疫机制方面的功能逐渐被发现并研究。其中,鉴定增强子是本领域研究的热点与难点。在全基因组水平上研究猪的增强子与其相关生物学的过程,鲜有报道。本研究利用Poly（I:C）刺激猪
【基金项目】
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国家重点研发计划项目子课题（2018YFD0500404）； 国家自然科学基金（31772563）；
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在猪的疾病治疗机制中,猪肺泡巨噬细胞3D4/21作为一种先天性免疫细胞,通过分泌细胞因子发挥着非常重要的作用。近年来的研究表明,增强子作为一种顺式调控元件,通过显著提高基因的表达水平,调控细胞类型特异性基因的时空选择性表达,在免疫机制方面的功能逐渐被发现并研究。其中,鉴定增强子是本领域研究的热点与难点。在全基因组水平上研究猪的增强子与其相关生物学的过程,鲜有报道。本研究利用Poly（I:C）刺激猪肺泡巨噬细胞系,结合STARR-seq技术,在全基因组水平上鉴定并验证猪中与疾病感染模型相关的增强子,以期阐明疾病感染模型中增强子与靶基因之间的调控关系,为解析猪病毒性感染机制提供理论基础。论文主要结果如下:（1）在本课题组中构建了细胞STARR-seq的实验平台:通过多次实验摸索并优化试验流程,保证了后续测序数据质量。本研究对3D4/21的电转染参数进行优化,针对电转液的种类、指数波以及方波的不同电压三个方面进行改进,结果表明,当电转液是DPBS时,波形为指数波并且电压为200 V时,此时3D4/21的电转染效率最高,死亡率较低。（2）本研究在构建STARR筛选文库完成之后,从三个角度进行了验证:筛选文库中插入片段长度的检测、筛选文库限制性酶切的检测以及在一链反转录后DNA片段长度的检测,片段长度大小与预期一致,即STARR筛选文库构建成功。（3）在全基因组范围内,对猪肺泡巨噬细胞3D4/21的增强子元件进行鉴定:在正常细胞中鉴定到14,677个增强子,经Poly（I:C）刺激的细胞中鉴定到16,542个增强子,两者共同包含增强子为13,255个,所鉴定到的增强子大部分位于基因间区。（4）本研究将STARR-seq数据与ChIP-seq数据进行相关性分析,与组蛋白修饰H3K27ac、H3K4me1的系数分别为0.58和0.48,为正相关,共同验证STARR-seq技术的可靠性。（5）本研究将STARR-seq数据与ChIA-PET数据进行比对分析。ChIA-PET基于RNAPII、CTCF蛋白捕捉到染色质之间的相互作用,将增强子映射到这些相互作用区域,并用IGV对重合数据进行可视化,研究发现增强子位点与这些蛋白作用的锚点部分存在重合,表明所鉴定的增强子在3D4/21中发挥着重要的作用。（6）IFIT、MALAT1以及GBP基因在Poly（I:C）刺激之后,表达水平均表现为上升趋势,与其对应的STARR-seq增强子信号强度、ChIP-seq表观修饰、ChIA-PET染色质相互作用强度也随之提高,这些结果为STARR-seq增强子作为Poly（I:C）等双链RNA病毒类似物的药物学靶点提供理论依据。
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