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食品安全问题一直是人们关注的热点问题,随着食品中微生物污染和细菌耐药性的增强,以及一些化学防腐剂的禁用,给食品安全带来了很大的威胁。因此,寻找新的天然的、安全的食品防腐剂的开发日益成为研究的热点。枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为一种生物安全菌株,目前在工业、农业、畜牧业、生物防治以及食品上都有着广泛的应用前景。研究表明,枯草杆菌具有强大的分泌表达能力,且通过基因组测序发现,其具有合成多种抗菌物质的潜能。B.subtilis广泛分布于自然界包括堆肥在内的各种环境中。因此,植物堆肥作为一种重要的微生物资源库,可以作为筛选B.subtilis菌种的重要资源。本文从植物秸秆堆肥中筛选出一株具有广谱抗菌活性的枯草杆菌。通过基因组测序和生物信息学手段研究了其所含有的NRPS和I型PKS基因簇信息,然后利用分离纯化技术鉴定出该菌株代谢产物中与NRPS和I型PKS基因簇相关的活性物质结构。并证明了这些化合物具有一定的抑菌、抗肿瘤以及抗氧化活性。以期为该菌株的进一步应用奠定基础。本文主要研究结果如下:1、广谱抗菌活性菌株fmb60鉴定及基因组测序从堆肥中筛选得到一株细菌fmb60,抑菌试验结果表明,其发酵上清液对革兰氏阳性菌(Bacilluscereus ATCC 14579、Micrococcusluteus CMCC 28001、Bacilluspumilus CMCC 63202、Staphylococcus aureus ATCC 25923、Clostridium difficile CICC 22951、Bacillus megaterium CICC 10448)以及革兰氏阴性菌(Escherichia coli ATCC 25922、Pseudomonas fluorescens ATCC 49642)均具有出较强的抑制作用。通过生理生化鉴定和16SrDNA同源性比对,确定该菌株为枯草杆菌,并构建了该菌株的系统发育树。提取B.subtilis fmb60基因组,通过基因组测序共计得到3个scaffold序列。首先,预测和分析了该菌株所包含的次级代谢产物基因簇,结果显示该菌株含有17个次级代谢产物合成基因簇,其中包括3个NRPS基因簇,1个Ⅰ型PKS基因簇,1个NRPS/PKS基因簇。其次,通过基因簇分析发现3个NRPS基因簇和surfactin(srf)、fengycin(fen)、bacillibactin(dhb)合成酶高度同源,分别达到了 78%,100%和92%;Ⅰ型PKS基因簇与杆菌属产物calyculin的合成基因簇有一定的同源性,为64%;NRPS/PKS合成基因簇xenocoumacin的合成基因簇有一定的同源性,为28%。2、NRPS基因簇代谢产物的鉴定及bacillibactin的抗氧化活性研究利用酸沉、SephhadexLH-20层析和HPLC制备从B.subtilis fmb60发酵液中分离得到3种抗菌物质。通过HPLC-MS/MS以及NMR鉴定,这些物质分别为NRPS合成的 surfactin、fengycin 和 bacillibactin。并利用肉汤稀释法测定了 surfactin、fengycin和 bacillibactin 对不同指示菌的 MIC,结果表明 surfactin 和 bacillibactin 对 B.cereus ATCC 14579、B.pumilus CMCC 63202、M.luteus CMCC 28001 和 S.aureus ATCC 25923具有较好的抑制活性,对E.coli ATCC 25922和P.fluorescensATCC 49642有一定的抑制活性,而fengycin对所测试的6种指示菌均无明显的抑制活性。通过化学法(包括清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、还原力、总抗氧化能力)及大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞模型法研究bacillibactin的体外抗氧化活性。结果表明,bacillibactin比Vc显示出更好的体外抗氧化活性,且在不同浓度下呈现一定的浓度依赖性。细胞氧化损伤实验显示,通过bacillibactin(<200 μg/mL)预处理细胞后,对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤具有明显的保护作用。3、Aurantinins类化合物的结构鉴定及其对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究通过酸沉、乙酸乙酯萃取、SephhadexLH-20层析以及HPLC纯化,从B.subtilis fmb60发酵液中分离出了 3种抗菌物质,分别为aurantinin B、aurantinin C和aurantinin D。同时采用HPLC-HRMS/MS和NMR法鉴定了这3种物质的结构,表明aurantininC和aurantinin D为新化合物。采用肉汤稀释法测定了这3种化合物对不同指示菌的MIC。结果表明,aurantinin B、aurantinin C、aurantinin D 对S.aureus ATCC 25923、M.luteus CMCC 28001、B.pumilusCMCC 63202、B.cereus ATCC 14579、B.subtilis ATCC 168、L.monocytogenes CICC 21662、E.faecalis ATCC 29212、P.fluorescens ATCC 49642 和 aureus(MRSA)均具有较强的抑制作用,尤其是对厌氧菌具有很强的抑制活性,而对E.coli ATCC 25922没有明显的抑菌效果。然后研究了这3种化合物对肝细胞L02和结肠癌Caco2细胞细胞毒性。结果显示,aurantinin B、aurantinin C、aurantinin D 对 L02 和 Caco2细胞系均无较强的细胞毒性(IC50>100μg/mL)。采用S.aureus ATCC25923为模型初步研究了这3种化合物的抗菌机制。结果表明,aurantinin B、aurantinin C、aurantinin D 在与 S.aureus 作用 1 h 后,即可观察到明显的抑制效果。细胞的胞内物质开始泄漏。同时通过对S.aureus培养液中蛋白类、核酸类物质的测定以及利用SEM、TEM观察发现,aurantinin B、aurantinin C、aurantinin D主要以S.aureus的细胞壁膜为作用靶点,使S.aureus的菌体壁膜完整性遭到破坏,导致细胞内物质泄漏。此外,通过对这3种化合物的结构分析和基因簇预测,表明B.subtilis fmb60基因组中的Ⅰ型PKS基因簇为aurantinins的合成基因簇。4、Amicoumacins类化合物的结构鉴定及其生物活性的研究通过乙酸乙酯萃取、SephhadexLH-20层析、HPLC纯化,从B.subtilis fmb60发酵液中得到 16 种化合物,分别为 lipoamideD、lipoamideE、lipoamideF、bacillmacin A、bacillmacin B、N-acetylmethy amicoumacin C、amicoumacin A、amicoumacin B、amicoumacinC、bacilosarcinA、bacilosarcinB、bacilosarcinC、N-acetylamicoumacinB、N-acetylamicoumacin C、AI-77-H和 Lipoamicoumacins B。应用 HPLC-MS/MS 以及NMR技术对其结构鉴定表明,其中 lipoamideD、lipoamideE、lipoamideF、bacillmacin A和bacillmacin B为新化合物,N-acetylmethy amicoumacin C为新的天然产物。同时抗菌实验表明 amicoumacin A 和 bacilosarcin B 对 S.aureus ATCC 25923、M.luteus CMCC 28001、B.pumilus CMCC 63202、B.cereus ATCC 14579、L.monocytogenes CICC 21662、P.fluorescens ATCC 49642、aureus(MRSA)均具有较好的抑菌作用,特别是化合物 bacilosarcin B 对 S.aureus(MRSA)的 MIC 值为 3.13 μg/mL。利用MTT法测定了 amicoumacins类化合物对不同细胞株的IC50。结果显示,amicoumacin A 和 bacilosarcin B 对肝癌细胞(HepG2),胃癌细胞(Hgc-27),宫颈癌细胞(Hela)结肠癌(Caco2)细胞均具有较强的抑制作用,IC50为3.5μ 到19.3 μM;bacillmacin B对上述细胞的抑制活性为28.2 μM到39.1 μM。其他所分离得到的化合物的活性较弱。通过研究amicoumacins类化合物对铁离子还原能力、ATBS+自由基清除能力和PC12细胞模型探索了该类化合物的体外抗氧化能力,结果表明,化合物bacillmacin B、N-acetylmethy amicoumacin C、N-acetylamicoumacin B、AI-77-H 和 lipoamicoumacins B具有一定的抗氧化能力。另外,通过对B.subtilis fmb60基因组信息的分析和序列比对,表明其基因组上所含有的NRPS/PKS合成基因簇即为amicoumacins类化合物的合成基因簇。