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菜用大豆[Glycine max（L.）Merrill],又称毛豆,是我国长江中下游地区和东南沿海地区广泛种植的豆类蔬菜之一。其籽粒富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿质元素、膳食纤维和异黄酮等,具有独特的鲜食风味和较高的营养价值,深受国内外消费者青睐。我国是菜用大豆的重要出口国,由于国内外市场需求的增加以及良好的经济效益,菜用大豆栽培面积逐年扩大。然而,由于受海潮和海水型地下水的影响以及目前生产中不合理的灌溉方式和化肥过量施用等影响,沿海地区等菜用大豆主产区土壤盐渍化严重。盐渍化和次生盐渍化已成为影响菜用大豆生产的重要限制因素,严重降低了鲜英产量和籽粒品质。为提高菜用大豆耐盐性,获得耐盐新种质,本研究从耐盐野生茄子（Solanum torvum Swartz）中克隆了脯氨酸合成途径的关键酶基因—Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（StP5CS）,并构建过表达植物表达载体遗传转化菜用大豆,成功获得了稳定遗传的纯合体转基因后代。通过基质培和营养液栽培两种方法对获得的T2和T3代纯合体转基因株系进行耐盐性鉴定,研究了过表达StP5CS对菜用大豆生长发育和耐盐性的影响。主要研究结果如下:1.采用同源克隆的方法从野生茄子耐盐砧木品种’Torvum Vigor’叶片中克隆了StP5CS（GenBank登录号:JN606861）。StP5CS核苷酸序列总长2232 bp,包含42 bp的5’端非翻译区,2154 bp的编码区和36 bp的3’端非翻译区。其中编码区编码717个氨基酸的蛋白质,推导蛋白的分子量为77.87 kDa,等电点为6.26。核苷酸序列比对显示,StP5CS与番茄tomPRO2、大豆GmP5CS、乌头叶豇豆VaP5CS以及拟南芥AtP5CSW、AtP5CS2的相似性分别为94%、77%、75%、74%和74%,其中与tomPRO2的相似性最高,推测为同源基因。多重氨基酸序列比对分析发现,推导蛋白StP5CS具有高等植物P5CS蛋白特有的6个保守结构域,包括ATP结合位点、谷氛酰激酶结构域、谷氛酸半醛结构域、NADPH结合位点和两个亮氨酸拉链结构域,说明StP5CS与已经报道的P5CS蛋白可能具有相类似的功能,在脯氨酸的生物合成过程中发挥重要作用。分子进化分析表明,StP5CS与番茄tomPR02及烟草NtP5CS的亲缘关系最近。2.构建了含有报告基因gus,选择标记基因bar以及目的基因StP5CS的抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-T800-StP5CS。以双元植物表达载体pCAMBIA3301为基础载体,在多克隆位点处插入CaMV35S启动子和NOS终止子,构建了中间载体pCAMBIA3301-T800。采用错配PCR的方法在StP5CS的上游和下游分别引入BamHI和SalI两个酶切位点,通过T4 DNA连接酶将StP5CS克隆到中间载体CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成最终的表达载体pCAMBIA3301-T800-StP5CS。经酶切和测序验证后,将该重组表达载体通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105,获得了用于遗传转化的农杆菌工程菌。3.利用农杆菌介导法将StP5CS导入菜用大豆’NY1001’,在T2代中成功筛选到两个纯合体转基因株系（编号Z1-3和Z2-7）。将含StP5CS植物表达载体的根癌农杆菌菌液侵染子叶节,共培养4天后,以4mg·L-1的双丙氛膦进行抗性芽的筛选,在芽伸长早期通过半叶法GUS组织化学检测筛选获得4个独立的GUS阳性转化芽。生根驯化后,经过PCR、Southern杂交检测确认最终获得2株可育的T0代转基因植株。除草剂Basta叶片涂抹检测表明,转基因植株具有抗除草剂特性。卡方测验分析显示外源基因在T1代中以3:1的比例分离,符合孟德尔遗传模式。对T2代转基因植株进行PCR鉴定,初步筛选得到了2个纯合的转基因株系。4.对T2和T3代纯合体转基因株系进行耐盐性鉴定,证实过表达StP5CS可以提高转基因菜用大豆的耐盐性并且这一耐盐特性可以稳定遗传到后代。分别采用基质培和营养液栽培法对T2代和T3代纯合体转基因株系进行耐盐性鉴定,盐胁迫10天后（基质培:200 mM NaCl;营养液培:100mM NaCl）转基因株系的盐害级别显著低于对照植株,而株高、最大单叶叶面积、相对叶绿素含量和鲜荚数则显著高于对照植株。过表达StP5CS促进了转基因植株叶片中游离脯氨酸的大量积累,无论是非盐处理还是盐胁迫条件下,转基因株系叶片游离脯氨酸含量均显著高于对照。盐胁迫处理后,转基因株系叶片丙二醛含量显著低于对照植株,说明转基因株系叶片的膜脂过氧化程度较低,受盐胁迫伤害程度显著低于对照。荧光定量分析表明,StP5CS在转基因株系中大量表达,而对照株系中并没有StP5CS的表达。双因素方差分析结果表明,StP5CS的表达受到NaCl处理、株系以及NaCl处理与株系互作的显著影响。这些结果表明过表达StP5CS提高了转基因菜用大豆的耐盐性,并且这一耐盐特性可以遗传到后代中。所获的转StP5CS耐盐菜用大豆新种质可用于后续耐盐新品种培育。