[目 的]检测中心粒旁物质1（Pericentriolar material 1,PCM1）在不同疾病严重程度的溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）患者肠粘膜中的水平,在临床层面初步探索PCM1与UC的相关性。在细胞层面,探索PCM1在炎症反应和免疫调控中的作用机制。进一步在临床样本中,验证上述机制涉及的通路因子与UC的相关性。旨在阐明PCM1在UC发生中的作用机制,为寻找UC治疗的新靶点奠定基础。[方 法]本研究分为三个部分:第一部分（临床层面）:1.选取健康对照者30例,UC患者98例,其中轻度UC患者32例、中度UC患者34例、重度UC患者32例,收集其肠粘膜。通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测PCM1在肠粘膜中的表达和定位,初步探索PCM1与UC的相关性。2.选取健康对照者10例,轻度、中度及重度UC患者各10例,收集其肠粘膜。通过qRT-PCR和Western blotting检测PCM1在肠粘膜中的转录及表达水平,进一步验证PCM1与UC的相关性。第二部分（细胞层面）:1.研究PCM1在炎症反应中的作用1.1采用梯度浓度的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）分别构建THP-1细胞和Caco-2细胞的炎症模型,通过Western blotting检测PCM1蛋白水平,探索PCM1与炎症反应的相关性;1.2构建稳定表达或干扰PCM1基因的THP-1细胞株和Caco-2细胞株;1.3分别在THP-1细胞和Caco-2细胞中,干扰和过表达PCM1水平,采用LPS刺激细胞模拟炎症环境,通过ELISA检测细胞上清液中促炎因子（TNF-α、IL-1β及IL-18）和抗炎因子（TGF-β和IL-4）的含量,明确PCM1在炎症反应中的作用。2.研究PCM1调控炎症的免疫通路基于上一步研究结果提供的线索,进行PCM1在免疫调控中的机制研究。2.1干扰和过表达THP-1细胞中的PCM1水平,LPS+ATP处理细胞,Western blotting 检测 PCM1 对 NLRP3 炎症小体（NLRP3、ASC 及 caspase-1）的影响。2.2干扰和过表达THP-1细胞中的PCM1水平,LPS+ATP构建细胞焦亡模型,Western blotting检测焦亡介导蛋白gasdermin D的表达水平,ELISA检测细胞上清液中焦亡相关因子（IL-1β和IL-18）的含量,明确PCM1对细胞焦亡的作用。2.3干扰和过表达THP-1细胞中的PCM1水平,LPS+ATP构建细胞焦亡模型,运用三种技术方法,从不同的角度验证PCM1对焦亡的影响:（1）TUNEL染色实验检测PCM1对细胞DNA损伤的影响;（2）PI染色实验检测PCM1对细胞膜完整性的影响;（3）LDH释放实验检测PCM1对细胞膜通透性的影响。第三部分（临床层面）:1.利用透射电镜观察健康对照者和不同疾病严重程度UC患者肠粘膜组织的超微结构和细胞焦亡水平。2.选取健康对照者10例,轻度、中度及重度UC患者各10例,收集其肠粘膜,制作蜡块、切片。采用TUNEL染色检测肠粘膜中细胞DNA损伤情况;利用 IHC 检测 PCM1 激活的 NLRP3/caspase-1/gasdermin D/IL-1β、IL18 通路蛋白在肠粘膜中的表达和定位。3.选取健康对照者8例,UC患者16例,收集其肠粘膜,提取总RNA和总蛋白,通过 qRT-PCR 和 Western blotting 检测 PCM1 激活的 NLRP3/caspase-1/gasdermin D/IL-1β、IL18通路因子在肠粘膜中的转录及表达水平。[结 果]第一部分（临床层面）:1.IHC染色显示PCM1表达于肠黏膜的上皮细胞和炎症细胞的细胞质中,在肠粘膜淋巴滤泡生发中心内强表达。PCM1阳性细胞比例在健康对照组和轻、中、重度 UC 组中分别为（0.12±0.17）、（1.31±1.59）、（0.97±1.54）、（0.27±0.38）,PCM1的表达具有差异性,F（P）=7.711（<0.0001）。组间比较显示:与健康对照者相比,UC患者肠粘膜内PCM1水平显著升高（P均<0.05）,重度UC组PCM1水平低于轻度UC组（P<0.01）。2.qRT-PCR和Western blotting检测显示,与健康对照者相比,UC患者肠粘膜组织内PCM1的mRNA和蛋白水平均升高;进一步分析PCM1与UC疾病严重程度的相关性,发现PCM1在轻、中度UC患者中含量最高,在重度UC患者中呈现下降趋势。上述结果均具有统计学意义（P均<0.05）。第二部分（细胞层面）:1.在THP-1细胞和Caco-2细胞中,PCM1表达水平随LPS浓度升高而增加,达到峰值后降低。2.成功构建稳定表达或干扰PCM1基因的THP-1细胞株和Caco-2细胞株。3.在LPS诱导的THP-1和Caco-2细胞炎症模型中,PCM1促进促炎因子（TNF-α、IL-1β及IL-18）分泌,抑制抗炎因子（TGF-β、IL-4）分泌,且该趋势在THP-1细胞中更为显著。提示PCM1可促进炎症反应。4.在LPS+ATP诱导的THP-1细胞中,干扰PCM1可降低NLRP3、caspase-1及cleaved caspase-1的表达水平;反之,过表达PCM 1可升高NLRP3、caspase-1及cleaved caspase-1的表达水平。提示PCM1可促进NLRP3炎症小体的激活。5.在LPS+ATP建立的THP-1细胞焦亡模型中,干扰PCM1可降低gasdermin D、gasdermin D-N的表达水平,抑制IL-1β、IL-18的释放;反之,过表达PCM1可升高gasdermin D、gasdermin D-N的表达水平,促进IL-1β、IL-18的释放。提示PCM1可触发gasdermin D介导的细胞焦亡。6.TUNEL染色显示,在LPS+ATP建立的THP-1细胞焦亡模型中,加入LPS+ATP后,TUNEL阳性细胞比例增加（P<0.001）。干扰PCM1组（shPCM1+LPS+ATP）的TUNEL阳性细胞比例较干扰对照组（shCtrl+LPS+ATP）降低（P<0.01）;反之,过表达PCM1组（mPCM1+LPS+ATP）的TUNEL阳性细胞比例较过表达对照组（mCtrl+LPS+ATP）升高（P<0.001）。加入焦亡抑制剂NSA后,可降低TUNEL阳性细胞比例（mPCM1+LPS+ATP+NSA vs mPCM1+LPS+ATP,P<0.001）。提示PCM1可加重细胞DNA损伤,加重细胞焦亡。7.PI染色显示,在LPS+ATP建立的THP-1细胞焦亡模型中,加入LPS+ATP后,PI阳性细胞比例增加（P<0.05）。干扰PCM1组（shPCM1+LPS+ATP）的PI阳性细胞百分比较干扰对照组（shCtrl+LPS+ATP）降低（P<0.001）;反之,过表达PCM1组（mPCM1+LPS+ATP）的PI阳性细胞比例较过表达对照组（mCtrl+LPS+ATP）升高（P<0.05）。加入焦亡抑制剂NSA后,可降低PI阳性细胞比例（mPCM1+LPS+ATP+NSA vs mPCM1+LPS+ATP,P<0.001）。提示PCM1可破坏细胞膜的完整性,加重细胞焦亡。8.LDH释放实验显示,在LPS+ATP建立的THP-1细胞焦亡模型中,加入LPS+ATP后,LDH释放量显著增加（P<0.001）。干扰PCM1组（shPCM1+LPS+ATP）的LDH释放量较干扰对照组（shCtrl+LPS+ATP）降低（P<0.001）。加入焦亡抑制剂NSA后,可降低LDH释放量（mPCM1+LPS+ATP+NSA vsmPCM1+LPS+ATP,P<0.001）。提示降低PCM1可减小细胞膜的通透性,减轻细胞焦亡。第三部分（临床层面）:1.透射电镜显示:与健康对照者相比,UC患者肠粘膜内的上皮细胞和炎症细胞均发生了焦亡形态学改变。同时,随着UC疾病严重程度加重,肠屏障结构损伤加重,细胞焦亡水平升高。2.TUNEL染色显示,与健康对照者相比,轻度、中度及重度UC患者肠粘膜中TUNEL阳性细胞比例均增加（P均<0.05）。其中,重度UC患者肠粘膜中的TUNEL阳性细胞比例高于轻度UC患者（P<0.05）。提示UC患者肠粘膜发生了 DNA损伤和细胞焦亡,且重度UC患者的焦亡水平最高。3.IHC 结果显示 NLRP3、caspase-1、gasdermin D、IL-1β及 IL-18 表达于肠粘膜腺体和炎症细胞中,其中,caspase-1、gasderminD、IL-1β及IL-18在隐窝脓肿中强表达,caspase-1和IL-1β在肠粘膜淋巴滤泡生发中心内强表达。统计IHC阳性细胞比例,相较健康对照者,NLRP3、caspase-1、gasderminD、IL-1β及IL-18在UC患者肠粘膜中的表达水平均明显升高（P均<0.05）。4.qRT-PCR检测显示,相较健康对照者,UC患者肠粘膜中NLRP3、caspase-1、gasdermin D、IL-1β及IL-18的转录水平均明显升高（P均<0.05）。5.Western blotting检测显示,相较健康对照者,UC患者肠粘膜中NLRP3、cleaved caspase-1、gasdermin D-N、IL-1β及 IL-18 的蛋白表达水平均明显升高（P均<0.05）。[结论]1.UC患者肠粘膜组织中PCM1表达水平显著升高,其主要表达于肠粘膜的上皮细胞和炎症细胞中,在淋巴滤泡生发中心内呈现强表达,提示PCM1可能参与了 UC的炎症反应和免疫调控。2.在THP-1、Caco-2细胞中,PCM1的表达水平与LPS具有一定浓度依赖性。在LPS诱导的THP-1和Caco-2细胞炎症模型中,PCM1促进促炎因子分泌,抑制抗炎因子分泌,提示PCM1可促进炎症反应。在LPS+ATP诱导的THP-1细胞焦亡模型中,PCM1 通过激活NLRP3/caspase-1/gasdermin D/IL-1β、IL18 免疫通路,促进焦亡发生。3.UC患者肠粘膜组织发生了细胞焦亡和细胞DNA损伤,PCM1激活的NLRP3/caspase-1/gasdermin D/IL-1β、IL18通路因子在UC患者肠粘膜中高水平表达。总结论:PCM1异常表达可激活NLRP3炎症小体,触发gasdermin D介导的细胞焦亡,引发促炎因子IL-1β和IL-18的释放,促进UC的炎症发生。