论文部分内容阅读
【目的】观察防龋基因疫苗pVAX1-GC经不同途径免疫BALB/c小鼠和SD大鼠后特异性抗体水平和降低SD大鼠龋齿的程度,通过动物体重等一般安全性指标的检查,初步筛选出该疫苗的有效免疫途径,为新型防龋基因疫苗pVAX1-GC的进一步研究提供实验依据。【方法】本研究包括三个实验实验一:重组质粒pVAX1-GC及空载体质粒pVAX1的鉴定和大量制备。1.先小量抽提储存的重组质粒pVAX1-GC及空载体质粒pVAX1。2.经限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pVAX1-GC及空载体质粒pVAX1是否正确。3.在鉴定正确的基础上,大量抽提重组质粒pVAX1-GC及空载体质粒pVAX1,紫外分光光度计测定所抽提的重组质粒的OD值,并计算其浓度和纯度,贮存于-80℃冰箱中以备免疫动物用。实验二:重组质粒pVAX1-GC免疫BALB/c小鼠的实验研究1.实验动物及其分组:6-8周龄健康BALB/c小鼠40只,随机分为5组,每组8只,分别为:A组(阴性对照组):用空载体质粒pVAX1股四头肌注射免疫动物。B组(空白对照组):用生理盐水鼻腔滴注免疫动物。C组:质粒pVAX1-GC鼻腔滴注免疫动物。/D组:质粒pVAX1-GC双侧颌下腺区皮下注射免疫动物。E组:质粒pVAX1-GC股四头肌注射免疫动物。2.免疫时间、免疫剂量和样本采集:共免疫3次,每周免疫一次,连续免疫3周。每次每只小鼠免疫剂量为100μg。分别于免疫第0、1、2、3、4W(即实验进程第0、8、15、22、29d)采集血液、唾液样品。血清中IgG和唾液中S-IgA采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测。3.动物一般安全性的检验:每周称量各组动物的体重,并于实验结束后处死动物,取心、肝、脾、肺、肾进行病理学检查,观察实验组与对照组各器官大体形态及其组织结构有无异常变化。实验三:重组质粒pVAX1-GC免疫SD大鼠的实验研究40只出生18天的SD大鼠,雄性,建立龋齿模型后随机分组。分组情况、免疫时间、免疫剂量、特异性抗体的检测及动物一般安全性检查的方法同实验二:分别于免疫前(即0周)和免疫后第1、2、3、4、5、6W(即鼠龄28、35、42、49、56、63、70d)取血清和唾液样本。鼠龄70天时,处死动物,并取上下颌骨,进行龋齿计分。【结果】①重组质粒pVAX1-GC经KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切为3.0bp和537bp两的两个片段,与目的基因片段大小相同。通过特大型质粒试剂盒抽提获得了纯度为1.890,浓度为1580μg/ml的高纯度质粒。②重组质粒pVAX1-GC经鼻腔黏膜滴注、颌下腺区皮下注射和股四头肌注射等三种途径免疫BALB/C小鼠和SD大鼠,在动物血液和唾液中均可检测到特异性抗体,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。③三种途径免疫SD大鼠后,大鼠患龋水平明显降低,与对照组比较有明显差异(P＜0.05)。④通过双侧颌下腺区皮下注射途径免疫动物诱导的唾液特异性S-IgA抗体水平最高。⑤免疫前后动物体重对照组和实验组之间无明显的差异(P＞0.05)。BALB/C小鼠和SD大鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器经大体观察均未发现明显异常,病理切片检查均无细胞核深染或核分裂像,胞质均匀,未见特异性病理改变。【结论】①防龋基因疫苗pVAX1-GC能有效诱导BALB/c小鼠和SD大鼠血液与唾液中特异性抗体的产生,表明重组质粒pVAX1-GC能在动物体内正确表达并诱导动物机体的系统免疫和粘膜免疫应答。②重组质粒pVAX1-GC免疫SD大鼠后,可以抑制大鼠龋齿的发生,有一定的防龋效果。③双侧颌下腺区皮下注射免疫有望成为防龋基因疫苗pVAX1-GC的最有效免疫途径。④重组质粒pVAX1-GC免疫动物后,未见对动物体重和心、肝、脾、肺、肾等重要脏器有明显影响。