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缺血再灌注(I/R)损伤是临床常见的病理现象,创伤与失血性休克、冠脉缺血和体外循环手术以及器官移植手术时I/R损伤不可避免,重者可影响患者预后。I/R损伤机制复杂,其发生机理仍不完全清楚,目前认为主要涉及氧自由基和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的大量产生、炎性损伤以及微循环障碍等过程,而启动这些环节的关键是细胞能量代谢障碍。线粒体作为细胞氧化磷酸化的重要细胞器,其功能改变与I/R损伤密切相关。前列腺素E2(PGE2)是生物体内重要的内源性调节因子。I/R损伤时,PGE2对肝脏组织的炎性反应和微循环灌注起到重要的调节作用。环氧化酶-2(COX-2)是调控体内PGE2生成的重要限速酶,已有研究证明COX-2在肝I/R损伤中发挥重要作用。课题组前期发现抑制COX-2能激活一种细胞内保护机制,即抑制线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放,减轻I/R损伤,但其具体分子机制并不完全清楚。PGE2在细胞膜上存在4种G蛋白偶联受体,即前列腺素E2受体1、2、3和4(PGE2 receptor 1,2,3和4,EP 1,2,3,4)。作为COX-2下游重要的G蛋白偶联受体,已有研究证实EP4在I/R时直接介导了PGE2的肝脏保护效应。但是,EP4信号与对再灌注时线粒体功能的影响并不清楚。本课题通过70%大鼠肝脏热I/R损伤模型,研究了EP4信号在肝脏I/R损伤中的作用和机制。采用可逆性的肝血管阻断法建立稳定、可靠的Sprague Dawley(SD)大鼠70%肝热缺血再灌注模型,通过血清酶学检测、组织病理学观察、荧光分子探针测定线粒体钙容纳力(mitochondria calcium capacity,CRC)以及免疫印迹检测线粒体相关信号通路来研究EP4激动剂对肝I/R时的线粒体保护效应及分子机制。方法:将雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(200g-230g)随机化分组:1.假手术组(Sham组):只打开其腹腔,分离血管,不给予夹闭缺血;2.缺血再灌注组(I/R组):采用经典的、可逆性的肝血管阻断法建立稳定、可靠的SD大鼠70%肝热缺血再灌注模型,夹闭肝左叶和肝中叶血管系统,形成肝脏中叶和左叶缺血,松开血管夹行再灌注;3.I/R+缺血预处理(IPC)组:于缺血前给予一次10min的短暂缺血,然后再灌注10min+70%肝脏热缺血60min再灌注;4.I/R+COX-2抑制剂NS-398(NS-398)预处理组:缺血前10min腹腔给予COX-2抑制剂NS-398(30mg/kg)+70%肝脏热缺血60min再灌注;5.I/R+EP4激动剂CAY10598(CAY)处理组:70%肝脏热缺血60min再灌注+于缺血前1.5h、缺血30min和再灌注即刻分三次腹腔内注射总剂量1mg/kg EP4激动剂CAY10598;6.I/R+CAY+Carboxy Atractyloside(CATR)组:70%肝脏热缺血60min再灌注+于缺血前1.5h、缺血30min和再灌注即刻分三次腹腔内注射总剂量1mg/kg EP4激动剂CAY10598+缺血30min前腹腔注射5mg/kg线粒体膜通透性转换孔开放剂Carboxyatractyloside。于再灌注2h和6h,取肝组织和血清。采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及Western Blot检测肝脏I/R损伤后不同时间点EP4受体的表达情况;行血清酶学、组织病理学监测肝损伤、荧光免疫法测定线粒体钙容纳力(CRC);信号机制研究方面采用ELISA法检测肝组织环磷酸腺苷(c AMP)和组织活性氧(ROS)水平;运用Western blot技术检测各组肝组织GSK-3β、p-GSK-3β、ERK1/2、p-ERK1/2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果:1.PCR和Real Time-PCR结果发现,正常肝组织EP1、EP2、EP3和EP4基因均有不同程度的表达,而与sham组比较,I/R后2h肝组织EP1、EP2和EP4受体的m RNA表达均明显升高。IPC能明显下调EP2和EP4受体的基因表达,而使用COX-2抑制剂NS-398预处理能下调EP4受体的基因表达。Western blot结果显示,与Sham组比较,I/R能显著促进再灌注2 h和6h肝组织EP4蛋白表达(P<0.05),而NS-398则能明显抑制该作用(P<0.05)。2.再灌注时检测血清AST和ALT水平,结果显示:I/R时血清AST和ALT水平显著升高,CAY预处理能明显降低再灌注2h和6h血清AST和ALT水平(P<0.05)。再灌注6 h肝组织H-E染色和TUNEL染色结果显示,再灌注6h I/R组肝细胞损伤明显,CAY能明显减轻肝细胞坏死,减少凋亡指数(P<0.05),提供肝保护。而MPTP开放剂CATR能显著逆转CAY的保护作用。透射电镜下观察细胞超微结构发现:CAY能减少再灌注2h肝细胞核固缩溶解,线粒体等细胞器形态明显改善。差速离心法制备再灌注2 h和6 h线粒体,使用Flex Station II荧光分析仪测定各组线粒体钙容纳力(CRC)显示:与I/R组比较,再灌注2 h和6 h CAY预处理能显著增加线粒体CRC,抑制MPTP开放,而CATR则能显著逆转CAY的作用(P<0.05)。3.再灌注6 h肝组织c AMP和ROS水平检测显示:I/R能诱导肝组织c AMP和ROS水平明显升高(P<0.01),与I/R组比较,CAY预处理能进一步促进肝组织c AMP浓度升高(P<0.01),降低ROS水平(P<0.05)。Western blot结果显示:再灌注2h和6h I/R组肝组织p-ERK1/2表达明显升高,CAY处理能进一步增加肝组织p-ERK1/2表达(P<0.05);再灌注2h I/R、I/R+CAY和I/R+CAY+CATR组肝组织p-GSK-3β表达均有不同程度升高,至再灌注6h各组p-GSK-3β表达呈下降趋势,与I/R组和I/R+CAY+CATR组比较,CAY能增加再灌注6h肝组织p-GSK-3β表达(P<0.05);再灌注2h和6h,I/R、I/R+CAY和I/R+CAY+CATR组p-JAK2表达均有不同程度升高,其中2h升高最为显著,与I/R组比较,CAY能抑制再灌注时肝组织p-JAK2的表达(P<0.05);再灌注2h和6h,I/R和I/R+CAY+CATR组p-STAT3表达均显著升高,而CAY组再灌注2h p-STAT3表达与sham和I/R组比较呈显著下降,至6h时逐渐升高(P<0.05),提示CAY能延缓再灌注时肝组织p-STAT3的表达升高。结论:1.作为COX-2信号下游重要位点,EP4直接参与了肝脏I/R损伤的病理过程。2.使用EP4激动剂CAY10598预处理激活EP4信号,能抑制再灌注时MPTP开放,减轻线粒体损伤,减少肝细胞坏死和凋亡。3.EP4可通过下游c AMP-ERK1/2信号进一步影响MPTP调控相关的GSK-3β和JAK2-STAT3信号改变,从而调控MPTP通透性,影响ROS生成,调控肝I/R损伤。