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植物在生长发育过程中受到各种环境因素的影响。在长期的进化过程中,植物形成了一系列完善的体系来接收并且传递外界环境给予的信号,光是其中一种非常重要的环境信号。植物通过光受体感知光信号。光受体接收光子并进行信号转导,产生各种光响应以适应外界环境的变化。模式植物拟南芥中目前发现了13个光受体,分别为红光/远红光受体、蓝光/UV-A受体和UV-B受体。隐花素是蓝光受体之一,首先在拟南芥中被发现。隐花素的氨基酸序列和蛋白结构与光裂解酶类似,是一种黄素蛋白,它结合的黄素辅因子FAD在体外发生光还原反应,该反应需要进化上高度保守的三个色氨酸(又称色氨酸三联体)组成电子传递链,提供并传递电子来完成。有假说认为色氨酸三联体依赖的光还原反应是蓝光受体隐花素的光激活机制。根据该假说,结合氧化态FAD的隐花素处于基态,当吸收光子后,光激发的FAD*获得一个电子(由色氨酸三联体提供并传递)和一个质子(未知来源)从而形成半还原态FADH?,该状态被认为是隐花素的激活态,光激活的隐花素呈现一种打开的构象,与其信号蛋白相互作用,并最终导致下游的一系列生理生化反应。但该假说也存在如下问题:首先,色氨酸三联体依赖的光还原反应现象大部分是在体外实验观察发现的;其次,被认为是隐花素祖先的光裂解酶的修复活性不需要色氨酸三联体依赖的光还原反应;最后,拟南芥CRY2在体内的生理生化活性也与色氨酸三联体依赖的光还原反应无关。目前支持该假说的唯一遗传学证据是关于拟南芥CRY1的研究,该研究证明色氨酸三联体中的两个色氨酸突变后,不仅影响CRY1体外的光还原反应,还会影响CRY1的功能。CRY1的光激活机制与其亲缘关系最近的CRY2以及次近的光裂解酶是否有所不同,目前尚无定论。本研究通过定点突变的方法,将拟南芥隐花素CRY1中的色氨酸三联体(W324、W377和W400)和其它两个进化上高度保守的色氨酸(W334和W356)逐个突变为氧化还原惰性的苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A),分析了突变体在体内和体外的生理生化特性,为进一步验证色氨酸三联体依赖的光还原反应对CRY1光激活的影响,探究CRY1的光激活机制提供实验依据。主要研究结果如下:1.CRY1色氨酸三联体突变体的体外光还原反应利用昆虫细胞表达系统表达并纯化了五个色氨酸三联体突变体蛋白质,简称为W324A、W324F、W377A、W377F和W400F。通过全光谱扫描,分析FAD不同氧化还原状态的特征吸收曲线发现,突变体蛋白在蓝光下不发生或仅发生极微弱的光还原反应,说明CRY1体外光还原反应需要色氨酸三联体的参与。2.CRY1色氨酸三联体突变体在体内的生理活性利用农杆菌介导法将目的基因转入cry1缺失突变体中,获得了过量表达的T3代转基因纯合株系,简称为GFP-CRY1、GFP-CRY1W324F、GFP-CRY1W324A、GFP-CRY1W377F、GFP-CRY1W377A、GFP-CRY1W400F和GFP-CRY1W400A。对这些转基因植物进行检测并发现:色氨酸突变体均保持了野生型CRY1的生理功能,例如,介导蓝光抑制下胚轴的伸长、介导蓝光促进花青素的积累和介导蓝光促进相关基因m RNA的表达;有两个突变体表现出比野生型CRY1更强的生理活性,GFP-CRY1W400A在红光、远红光和黑暗中均能保持以上的生理功能,呈现组成型活性;GFP-CRY1W377A与GFP-CRY1W400A相似,但活性较弱。上述结果说明,CRY1的生理活性不需要色氨酸三联体依赖的光还原反应。3.CRY1色氨酸三联体突变体在体内的光生化活性分析转基因植物中突变体蛋白的磷酸化反应,结果表明,所有突变体(除W400A)均能发生蓝光依赖的磷酸化反应,而W400A在黑暗和蓝光下均能被磷酸化。利用人胚肾细胞表达系统(HEK293T)共表达W400A和CRY1的信号蛋白SPA1,Co-IP结果显示,W400A和SPA1在黑暗和蓝光下均能相互作用,进一步证明W400A的组成型活性。将突变体蛋白和SPA1CT509在烟草叶片中进行瞬时表达,Bi FC结果证明,所有突变体均能与SPA1CT509在植物体内发生互作。上述结果说明,CRY1的光生化活性不需要色氨酸三联体依赖的光还原反应。4.ATP促进的光还原反应对CRY1活性的影响在突变体蛋白中加入1 m M ATP,进行全光谱扫描,分析ATP对CRY1及其色氨酸突变体光还原反应的影响。结果表明:与报道的ATP促进CRY2的光还原反应不一致,ATP不能促进CRY1的光还原反应;ATP不能恢复W324A和W400F的光还原反应;ATP可以促进W324F、W377A和W377F的光还原反应,但仍慢于野生型CRY1。然而,这些突变体(特别是W324A和W400F)在体内仍具有CRY1的各项生理生化活性,因此推测,ATP促进的光还原反应与CRY1在体内的活性无关。5.其它CRY1色氨酸突变体的分析除色氨酸三联体以外,FAD的结合区域仍有两个进化上高度保守的色氨酸(W334和W356),对其进行相同的突变和检测,发现这两个点突变对于CRY1体外的光还原反应和体内的生理生化活性均没有显著影响。隐花素CRY1接收光子被激活,从而发生一系列生理生化反应。本研究表明,CRY1色氨酸三联体被突变后虽然不能进行体外的光还原反应,但仍能保持野生型CRY1的生理生化活性,说明CRY1色氨酸突变体在体内仍能被光激活并发挥相应的作用。因此,我们认为色氨酸三联体依赖的光还原反应不是隐花素CRY1的光激活机制。