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【背景】目前,乳腺癌已经成为最为主要的威胁女性生命健康的恶性疾病之一,该病防治是肿瘤研究领域的热点问题之一。人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)过表达于20%~25%乳腺癌,患者治疗预后差,易发生转移,HER2已经成为治疗乳腺癌的重要靶点。曲妥珠单抗(trastuzumab,商品名:herceptin,赫赛汀)是靶向HER2的人源化单克隆抗体,在HER2阳性乳腺癌早期治疗及转移治疗中取得较大成功。然而,trastuzumab耐药以及由此而导致的潜在转移性增加却一直困扰临床医生。近年来,乳腺癌trastuzumab耐药与乳腺癌转移研究取得显著进步,然而,乳腺癌trastuzumab耐药与转移相关性及其具体的分子机制尚需进一步阐明。TGF-β信号在肿瘤发生发展中具有重要作用并扮演着双重角色,一方面,其在肿瘤早期发挥增殖抑制与促凋亡作用,另一方面,其在肿瘤晚期可有效诱导肿瘤细胞发生并维持上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),从而促进肿瘤侵袭与转移。此外,TGF-β信号在多种肿瘤放射与药物治疗抵抗中的作用逐渐引起重视,成为肿瘤研究领域的热点。越来越多的证据表明,TGF-β信号在肿瘤耐药与转移中具有重要作用,有望成为重要的肿瘤治疗靶点。然而,关于TGF-β信号在乳腺癌trastuzumab耐药及伴随潜在转移性增加中的作用及其自身调控机制尚不明确。Mi RNAs是一类小分子RNA,通过靶向调控蛋白质而广泛参与肿瘤发生、发展。因此,阐明mi RNA在介导TGF-β信号调控HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药和转移中的潜在作用及其分子机制,将为乳腺癌多重恶性表型的逆转提供新的思路,对于乳腺癌临床治疗具有重要意义。【目的】阐明mi RNA参与TGF-β信号调节并调控乳腺癌trastuzumab耐药与转移的潜在作用机制,为trastuzumab耐药或者转移乳腺癌治疗提供新的思路。【方法】通过持续加药培养野生型(wide type,WT)乳腺癌细胞的方法建立体外乳腺癌trastuzumab耐药(trastuzumab resistant,TR)细胞模型,MTT检测分析乳腺癌WT与TR乳腺癌细胞对trastuzumab药物敏感性。软琼脂克隆形成实验分析WT与TR乳腺癌细胞非锚定依赖生长能力;transwell侵袭实验分析WT与TR乳腺癌细胞侵袭能力;对WT与TR乳腺癌细胞进行形态学观察,实时定量PCR(quantitative realtime PCR,q PCR)检测EMT转录因子水平,WB检测EMT标记分子,以观察细胞诱发EMT。WB检测乳腺癌WT与TR乳腺癌细胞TGF-β信号激活状态,q PCR与ELISA检测分析TGF-β的表达。RNA干涉TGF-β受体Ⅱ(TGF-βreceptorⅡ,TGFBR2)后,MTT检测TR乳腺癌细胞trastuzumab敏感性,transwell实验检测TR乳腺癌细胞侵袭力,q PCR检测EMT相关转录因子水平变化。通过mi RNA芯片分析筛选WT与TR乳腺癌细胞中显著差异表达的mi RNAs。MTT与流式细胞术凋亡检测分析mi R-200c对乳腺癌细胞trastuzumab敏感性的影响。Traswell与划痕实验分析mi R-200c对乳腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响。形态学观察分析与WB检测分析mi R-200c对EMT形态及标记分子的影响。WB检测分析mi R-200c对乳腺癌细胞TGF-β信号的影响,q PCR与ELISA检测分析mi R-200c对TGF-β表达的影响。裸鼠体内成瘤与肺转移实验分析mi R-200c对乳腺癌在动物体内trastuzumab耐药与转移的影响。软件预测mi R-200c靶蛋白并使用双荧光素酶报告基因、q PCR及WB等实验进行靶标验证。MTT与流式细胞术凋亡检测验证靶蛋白对trastuzumab敏感性的影响,Traswell与划痕实验验证靶蛋白对乳腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响,形态学观察靶蛋白对EMT形态影响,WB分析靶蛋白对EMT标记分子的影响。QPCR、WB与ELISA方法分析细胞中是否存在调控乳腺癌trastuzumab耐药的mi R-200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式环路。【结果】通过对乳腺癌细胞施加5μg/m L trastuzumab持续药物筛选约6个月,成功建立体外TR乳腺癌细胞模型。相较于WT乳腺癌细胞,MTT结果表明TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性显著减低;软琼脂克隆形成实验与transwell结果表明,TR乳腺癌细胞非锚定依赖生长能力与侵袭力显著增加;形态学观察、WB检测EMT标记物、q PCR检测EMT相关转录因子结果均表明TR乳腺癌细胞发生并维持明显EMT。相较于WT乳腺癌细胞,WB结果表明,TR乳腺癌细胞TGF-β信号激活水平显著升高;q PCR与ELISA结果表明,TR乳腺癌细胞TGF-βm RNA水平与分泌水平均显著升高。Si RNA干涉TGFBR2后,MTT结果表明TR乳腺癌细胞trastuzumab敏感性显著提高,transwell结果表明TR乳腺癌细胞侵袭力显著下降,q PCR结果表明TR乳腺癌细胞中EMT相关转录因子显著下调。Mi RNA芯片结果表明mi R-200c在TR乳腺癌细胞中降低最为显著。MTT与流式细胞术凋亡检测结果表明,mi R-200c可使TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性显著提高;transwell与划痕实验结果表明,mi R-200c可显著降低TR乳腺癌细胞侵袭与迁移能力;形态学观察与WB结果表明,mi R-200c可有效逆转TR乳腺癌细胞EMT;WB结果表明,mi R-200c可显著抑制TGF-β信号;q PCR与ELISA结果表明,mi R-200c可显著下调TR乳腺癌细胞中TGF-β2与TGF-β3的m RNA水平与分泌蛋白水平。裸鼠体内成瘤与尾静脉肺转移实验结果表明,mi R-200c可在体内使TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性提高并抑制其转移。软件预测、双荧光素酶报告基因检测、q PCR及WB结果表明,mi R-200c直接靶向锌指蛋白ZNF217与转录因子ZEB1。Si RNA干涉ZNF217与ZEB1均可逆转TR细胞trastuzumab耐药和EMT,并降低其侵袭与迁移能力。此外,q PCR、WB及ELISA结果表明乳腺癌中mi R-200c、ZNF217、TGF-β、ZEB1共同构成mi-R200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式调节环路。【结论】本研究发现乳腺癌诱发trastuzumab耐药的同时,伴发EMT、非锚定依赖生长能力与侵袭能力的增强等恶性表型。TGF-β信号同时在乳腺癌trastuzumab耐药细胞的耐药性、EMT及侵袭力增强等多种恶性表型的诱导与维持中具有重要作用。通过进一步研究发现,mi R-200c通过靶向ZNF217与ZEB1调控TGF-β信号,逆转乳腺癌trastuzumab耐药并同时抑制乳腺癌转移。最后,我们还发现,在乳腺癌中,mi R-200c、ZNF217、TGF-β、ZEB1共同构成mi R-200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式调节环路。这些研究结果阐释了调控乳腺癌恶性表型诱导与维持的新机制,并为其治疗提供了新的理论依据。