动物乳腺生物反应器是利用转基因技术,将乳腺特异性调控元件指导的外源功能基因,在乳腺组织中高效表达高产值的人类医用蛋白。通过哺乳动物乳腺生产重组蛋白,成本低,产量高,可持续生产,尤其是所表达的重组蛋白可进行翻译后加工修饰,具有天然蛋白的结构及活性等优点而成为当前国内外生物反应器研究的热点课题。该研究的关键是乳腺特异性高效表达载体的构建,包括乳腺特异性表达的调控元件及其能够提高外源基因表达的顺式作用因子的使用。构建好的乳腺特异性表达载体在制作转基因动物之前须进行构件有效性的验证,乳腺上皮细胞体外培养因具有操作简便、实验条件可人为控制和经人工激素诱导可表达蛋白、表达产物纯净、检测较简便且实验结果较稳定等优点无疑成为一种理想的实验材料。本研究就是基于以上原理而设计,旨在验证增强子和绝缘子等顺式作用因子对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因调控序列指导的人乳铁蛋白基因（hLF）在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响,从而筛选出高表达量的载体进一步做转基因动物研究。将山羊β-乳球蛋白基因调控序列,包括4.2kb的5`端和1.8 kb的3`端,人乳铁蛋白（hLF）cDNA,人巨细胞病毒增强子序列及SV40 polyA序列和新霉素抗性筛选基因（Neor ）、双拷贝的鸡β-珠蛋白绝缘子基因（Insulator）等上述基因元件体外重组构建成人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体BLC14和BLCDI。采用胶原酶和透明质酸酶共同消化法从健康的泌乳期奶山羊乳腺组织中分离到原代乳腺细胞;采用胰蛋白酶消化和反复贴壁法在DMEM/F12培养液中培养2-3代,获得纯化的乳腺上皮细胞。通过电转染法将表达载体BLC14和BLCDI导入纯化乳腺上皮细胞中,经G418筛选10d左右,利用Neor基因筛选抗G418的细胞单克隆传代扩大培养,分别获得63株和41株。经PCR检测确认,分别有21株和13株细胞克隆整合有外源基因。对整合有外源基因的细胞株进行催乳素诱导表达,分别收集诱导后48h的细胞上清夜进行ELISA检测,结果分别有14株和8株能检测到人乳铁蛋白的表达。其中转染BLC14基因的细胞株表达量高,但表达不稳定;而转染BLCDI的细胞株表达量相对较低,但表达较稳定。研究结果表明,表达载体BLC14和BLCDI构建合理正确,山羊β-乳球蛋白调控元件可以指导hLF cDNA在乳腺上皮细胞中表达人乳铁蛋白,人巨细胞病毒增强子可以促进其高水平表达,而双拷贝的鸡β-珠蛋白绝缘子基因能够消除外源基因的“位置效应”,稳定其表达。