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2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径是近些年来发现的一条新的萜类化合物合成途径,该途径共有七步反应,每个反应都有其独特的酶参与。MEP途径不存在于人体中,但存在于大多数致病菌、疟原虫以及高等植物中,故以MEP途径中的关键酶为靶点筛选新型抗菌化合物成了一个研究热点,然而目前对MEP途径关键酶的作用机制研究还不够深入,这严重阻碍了以此途径为靶点进行新型抗菌化合物的筛选研究。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是MEP途径中的第一个关键酶,该酶在焦磷酸硫胺素(ThPP)的辅助下,催化丙酮酸脱羧后与D-甘油醛-3-磷酸(D-GAP)缩合形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。本课题组在对大肠杆菌DXS(简称EcDXS))的研究中发现,EcDXS除了具有合成DXP的活性外还可以催化D-GAP与磷酸二羟丙酮(DHAP)的互变异构反应,但关于该反应的催化机理尚不清楚。本文首先分析了抗菌化合物丹皮酚及其衍生物对EcDXS磷酸丙糖异构化活性的影响。先采用常规的蛋白表达和纯化技术制备了一批纯度较高且活性良好的EcDXS,然后采用柱前衍生高效液相色谱法检测了丹皮酚及其衍生物对EcDXS的抑制活性。研究表明部分丹皮酚衍生物对EcDXS磷酸丙糖异构化活性有一定影响,如化合物34在浓度为0.1mg/ml时对酶的抑制活性达到31.6%,但是影响不明显,这说明丹皮酚抗菌活性可能是通过更多的作用靶点实现的,其作用靶点也有可能为TPI,因此,需要我们对DXS的异构化机理进行深入研究,分析DXS异构化活性机制是否与TPI相同。因此,接下来我们尝试采用硅烷化-GC-MS法分析EcDXS催化磷酸丙糖异构化的反应机制。由于D-GAP和DHAP这两种磷酸丙糖不具有挥发性,不能直接进行GC-MS分析,这为DXS的异构化活性机理的研究带来了很大的阻碍,本研究旨在建立一种合适的化学衍生方法,通过对两种磷酸丙糖衍生化(如硅烷化反应),使之适合进行GC-MS分析,再采用原位氘标记的方法,揭示DXS酶催化异构化过程中质子迁移的情况。在该研究中首先采用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)分别对DHAP以及D-GAP进行了硅烷化反应,并对反应时间和温度进行了优化,初步建立了磷酸丙糖的硅烷化-GC-MS检测方法。我们利用所建立的方法分析了DXS催化D-GAP和DHAP异构化反应的结果,在以D-GAP为底物进行异构化反应的样品中检测到了D-GAP的硅烷基化产物。通过LC-MS的辅助分析发现,D-GAP和DHAP在失去磷酸基团并被2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生为苯腙分离度更高,故拟用二者的去磷酸基团产物D-甘油醛(D-GA)和二羟丙酮(DHA)为模型化合物进行硅烷基化和酰化研究,相关工作正在进行中。