近红外响应的混合价态铂纳米颗粒的抗菌效果研究

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研究目的:制备近红外响应的混合价态铂纳米颗粒,评估其体内外抗菌效果,探讨其抗菌机制。材料与方法:通过氯铂酸诱导聚丙烯酸-b-聚丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸(p AA100-b-p NIPAM200-b-p AA100,PNA)配位交联形成Pt(IV)纳米凝胶,该凝胶通过引入Na BH4,使未配位的Pt4+离子还原为Pt0原子核,而配位的Pt4+离子由于配体的保护作用而还原成为Pt2+离子壳。通过亲金属作用,Pt2+离子壳被锚定在Pt0原子核的表面上,最终形成混合价态铂纳米颗粒(dual-valent platinum nanoparticles,dv Pt NPs)。此外,零价铂纳米颗粒(zero-valent platinum nanoparticles,Pt(0)-NPs)和二价铂纳米颗粒(divalent platinum nanoparticles,Pt(II)-NPs)也按照类似的程序合成。另外,将Pt(0)-NPs和Pt(II)-NPs按照dv Pt NPs中Pt0和Pt2+的比例混合,形成物理混合铂纳米颗粒组(Pt(0)-Pt(II)-NPs)作为对照。在体外试验中,将革兰氏阴性的普通大肠杆菌(Escherichia coli,E coli)、诱导持留状态的大肠杆菌(持留菌)和革兰氏阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)与各铂纳米颗粒实验组共培养,并使用808 nm近红外光激发,通过测量细菌菌落形成单位(Colony-Forming Units,CFU),细菌活死染色以及生长曲线的测定,分析各种铂纳米颗粒在近红外激发前和激发后对细菌的杀灭作用。为了进一步了解dv Pt NPs对细菌作用的具体机制,采用扫描电子显微镜观察细菌形态,通过核酸泄露实验确认细菌壁膜结构的完整性,使用q PCR检测细菌DNA损伤修复基因的表达水平以及通过罗丹明降解实验和活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)观测各组铂材料对细菌氧化还原稳态的作用。最后,根据细菌ATP和膜电位水平检验各组铂材料对细菌代谢水平和膜电位的影响。为了进一步验证混合价态铂纳米颗粒在生物体内的抗菌性能,首先通过皮下注射细菌的方式构建小鼠皮下脓肿模型,再将各铂纳米颗粒悬浊液注射至患处,通过近红外光激发,5天后观察患处脓肿情况和皮损愈合程度。同时,处死各组小鼠,取患处组织匀浆后涂板,观察各组CFU来判断各组铂纳米颗粒在体内的抗菌效果;同时取患处组织,通过组织包埋、切片及染色确定各组铂纳米颗粒对组织愈合的作用。实验结果:使用H2Pt Cl6诱导的p AA100-b-p NIPAM200-b-p AA100(PNA)配位交联的Pt(IV)纳米凝胶,将其作为合成dv Pt NPs的模板。随后通过两步还原法制备了实验所用的dv Pt NPs及其对照组Pt(0)-NPs和Pt(II)-NPs。通过对三种铂纳米材料进行表征检测,Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs和dv Pt NPs的流体动力学直径分别为74.2±3.5 nm,90.1±2.7 nm和69.7±2.4 nm,它们的zeta电位分别为-13.96±0.41 m V、-8.12±0.27 m V和-8.90±0.31 m V。dv Pt NPs在紫外可见光谱的200nm和近红外波段都有吸收峰。在时间温度曲线测定实验、温度循环曲线实验、Pt2+离子累积释放实验,dv Pt NPs表现出较好的光热转换效率和光热稳定性,且dv Pt NPs中的Pt2+离子仅在近红外激发的条件下才释放出来。接下来,在体内外实验中检测了dv Pt NPs的抗菌性能。从体外细菌平板涂布法、细菌生长曲线、细菌死活染色和小鼠脓肿模型的结果中可观察到dv Pt NPs对革兰氏阴性菌和阳性菌都具有较好的抗菌效果,达到了90%以上,表现出广谱的抗菌性能;另外,dv Pt NPs在近红外激发后对耐药菌和持留菌这两种类型的抗生素抵抗菌都有杀灭作用。在具有较强的抗菌效果的同时,dv Pt NPs在CCK8实验中对L929和NIH3T3细胞的增殖无明显抑制作用,呈现出较低的生物毒性,并且该纳米颗粒可通过肝肾被代谢掉。最后,使用多种手段检测了dv Pt NPs的复合抗菌机制:dv Pt NPs不仅造成细菌表面收缩、凹陷和破洞,也能引起大肠杆菌“拉丝”,说明dv Pt NPs的抗菌机制来源于Pt0的光热作用和Pt2+离子的DNA损伤作用;dv Pt NPs可造成细菌膜穿孔现象,导致细菌核酸物质泄露;dv Pt NPs可影响细菌ROS水平来发挥抗菌作用;dv Pt NPs也干扰细菌的ATP水平;dv Pt NPs对细菌的膜电位具有较大的影响。实验结论:dv Pt NPs在体内外实验中,受到近红外的激发时表现出广谱抗菌性,能够达到精准协同多模式的抗菌效果,且具有较好的生物相容性,为将来功能型和条件响应型铂纳米颗粒应用于抗感染领域奠定了理论基础。
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