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目的:表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)是一种存在于细胞膜表面的受体蛋白,当与EGF等配体结合后,EGFR介导细胞内多种信号通路活化或EGFR自身的内吞降解,EGFR的功能与细胞的生长、发育、增殖、凋亡等多种生命过程密切相关。在肺癌、乳腺癌、宫颈癌等多种癌细胞中均有发现EGFR表达量升高。目前,针对EGFR的分子靶向治疗主要是从转录水平抑制基因表达和通过抗体或小分子药物抑制EGFR的活性。EHD2(EH-domain containing protein 2)是一种参与调解细胞膜表面受体内吞及内吞囊泡转运过程的蛋白质,该蛋白N端包含一个ATP酶结构域,用于水解ATP为自身生命活动提供能量;C端包含一个EH结构域,是与其他分子相互作用的结合位点。本课题目的在于探索EHD2是否对EGFR的内吞转运具有调节作用,并深入研究了EHD2的ATP酶结构域在EGFR内吞转运调节过程中的重要作用。进而从囊泡转运角度探索EGFR受体调控的新型分子机制,为EGFR相关肿瘤的靶向治疗开辟新的路径。方法:1.通过Western Blotting、免疫荧光技术验证降表达EHD2,过表达EHD2对EGFR表达量的影响及其与EGFR在细胞内的位置关系。2.EGF刺激下研究降表达EHD2,过表达EHD2对EGFR内吞转运的调节作用。3.利用免疫荧光技术检测EHD2对EGFR内吞转运调控通过何种途径实现。4.通过Western Blotting、免疫荧光技术验证ATP酶结构域突变型EHD2(T94A、I157Q)对EGFR表达量、内吞,及其与EGFR的共定位的影响。5.通过二维克隆形成实验,研究EGFR表达量变化对细胞克隆形成能力的影响。6.活细胞水平实时察EGF刺激下,ATP酶结构域突变型EHD2与EGFR的内吞转运及细胞形态变化。7.EGF刺激下,研究降表达EHD2,过表达EHD2野生型及ATP酶结构域突变型对细胞内微丝的影响。结果:1.降表达EHD2使EGFR表达量降低,过表达EHD2使EGFR表达量升高,免疫荧光显示野生型EHD2与EGFR存在明显共定位。2.在Hela细胞中,EGF刺激下,降表达EHD2加速了EGFR的内吞,过表达EHD2抑制了EGFR的内吞。3.在Hela细胞中,EGF刺激后,EHD2、EGFR主要与CAV1有共定位内吞泡,而EGFR自身的大部分与CLTC有共定位,但EHD2不与CLTC共定位。但在MCF7细胞中,EHD2、EGFR、CLTC三者共定位明显。4.过表达EHD2-T94A突变使EGFR表达量升高,并高于EHD2野生型组,过表达EHD2-I157Q突变使EGFR表达量降低。免疫荧光显示EHD2-T94A突变主要定位于细胞膜,使EGFR在膜定位增加,EHD2-T94A与EGFR在细胞膜存在明显共定位。EHD2-I157Q突变主要定位于细胞质,使EGFR在细胞质定位增加,EHD2-I157Q与EGFR在细胞膜与细胞质存在明显共定位。5.克隆形成实验显示降表达EHD2后Hela细胞克隆形成能力降低,过表达EHD2野生型Hela细胞克隆形成能力增强,过表达EHD2-T94A突变使Hela细胞克隆形成能力略有升高,并低于EHD2野生型组,过表达EHD2-I157Q突变使Hela细胞克隆形成能力升高,并高于EHD2-T94A组,低于野生型EHD2组。6.活细胞监测EGF刺激后ATP酶结构域突变型EHD2对EGFR内吞的影响,发现抑制EGFR内吞后可引起细胞内微丝结构的重组,293T细胞出现膨胀现象。7.在Hela细胞中,降表达EHD2、过表达EHD2野生型及突变型引起细胞内微丝的形态变化:降表达EHD2使细胞内应力纤维减少;过表达EHD2使应力纤维增多。过表达EHD2-T94A使应力纤维增多,并且细胞多呈现出饱满膨胀的形态;过表达EHD2-I157Q使细胞应力纤维明显减少。结论:1.EHD2与EGFR表达量呈正相关,推测EHD2主要通过调节EGFR内吞实现对EGFR表达量的调节。2.EHD2对EGFR的调节作用在Hela细胞主要通过调节caveolae内吞途径来实现,在MCF7细胞主要通过调节clathrin途径实现。3.EHD2-T94A突变增强EHD2对EGFR内吞的抑制能力,EHD2-I157Q突变降低EHD2对EGFR内吞的抑制能力。4.克隆形成实验证实EHD2表达量与克隆形成能力正相关,进一步证实EHD2对EGFR的调节作用。5.EGF刺激时,EHD2对EGFR内吞的影响会导致EGFR信号通路过度放大,影响细胞内微丝的形态变化,具体机制有待进一步研究。