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目的:布鲁斯菌（Brucella）是引起布鲁斯菌病（Brucellosis）的病原体。布鲁斯菌病可以引起人类的波状热,牛、羊、猪等家畜的流产。布鲁斯菌可分为六个种,即马耳他布鲁斯菌、流产布鲁斯菌、猪布鲁斯菌、绵羊布鲁斯菌、犬布鲁斯菌和沙林鼠布鲁斯菌。布鲁斯菌病是世界范围内较严重的人畜共患传染病之一,在我国北方地区内蒙古、山西、吉林、黑龙江、河北、宁夏等省区流行较广,布鲁斯菌病已经成为最严重的公共卫生问题之一。目前,对动物布鲁斯菌病的防治,依据各地区实际状况的不同,主要是采用疫苗免疫接种或检疫、扑杀的方法。迄今为止已有几种较成功的布鲁斯菌减毒疫苗应用于生产,国外使用的主要有牛种布鲁斯菌19（B.abortus strain 19,S19）疫苗、羊种布鲁斯菌Rev.1（B.melitensis Rev.1）疫苗、牛种布鲁斯菌45/20（B.abortus strain 45/20）疫苗和粗糙型牛种布鲁斯菌51（Rough strain B.abortus 51,RB51）疫苗。我国主要使用的是猪种布鲁斯菌S2（B.suis strain2,S2）疫苗。虽然这些减毒疫苗在布鲁斯菌病的防治上起到了积极的作用,但它们有的毒力较强,在推荐剂量使用时对于妊娠动物还存在流产的可能,对人类来说并不安全,存在着潜在感染人类的可能性,有的免疫保护率低,不能供人类应用。因此有必要研制和开发新型布鲁斯菌疫苗。因为布鲁斯菌是一种可以在细胞内寄生并造成感染的病原微生物,因此可以引起机体强烈的细胞免疫应答,在对抗细胞内寄生菌感染方面极具潜力的核酸疫苗就成为了人们关注的研究热点。核酸疫苗与常规疫苗相比除了在预防细胞内寄生菌感染方面效果较好外,还具有无感染风险、可激发长期的免疫应答、比减毒疫苗具有更高的稳定性并且易于制备、造价低等优点。现在已有核酸疫苗用于预防人和动物的多种病毒、真菌和寄生虫感染的报道。在布鲁斯菌核酸疫苗的研究报道中,除了用布鲁斯菌外膜蛋白基因构建的核酸疫苗外,还有一些用布鲁斯菌胞内蛋白基因构建核酸疫苗的报道。据报道,布鲁斯菌胞内蛋白如:L7/L12核糖体蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶等基因皆可作为布鲁斯菌核酸疫苗的候选基因并取得了较好的免疫效果。这说明,布鲁斯菌的胞内蛋白基因也可以作为核酸疫苗的候选基因。布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统是调节布鲁斯菌感知系统的蛋白,在不同种属的布鲁斯菌中具有很高的同源性。据报道,布鲁斯菌BvrR/BvrS缺失突变株表现出侵入细胞的能力减弱,不能抵抗溶酶体的消化作用,在细胞内的复制能力也减弱。更进一步的研究还发现,BvrR/BvrS的缺失使布鲁斯菌失掉对细胞杀菌多聚阳离子的抵抗作用,可增加布鲁斯菌细胞膜表面对表面活性剂的通透性。因此,BvrR/BvrS双组分系统与布鲁斯菌的毒力有关。鉴于该组蛋白在细胞内较保守不宜变异,不同种属的布鲁斯菌BvrR/BvrS基因具有高度同源性,如果该调节蛋白具有特异的免疫原性则可作为布鲁斯菌的核酸疫苗,使用这一种疫苗可预防多种属布鲁斯菌的感染,在布鲁斯菌病的特异性预防领域会有重要意义。本研究拟采用布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统中的BvrR基因作为靶基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中构建新型核酸疫苗pcDNA-BvrR,然后转染Vero细胞分析其在细胞内的瞬时表达情况。随后将重组真核表达质粒pcDNA-BvrR免疫BALB/c小鼠来探讨BvrR基因核酸疫苗的免疫效果。这些研究为进一步探讨布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的免疫机理以及保护效果提供依据。利用BvrR基因在布鲁斯菌种属之间具有高度同源性的特点,用一种核酸疫苗将可以预防多种属布鲁斯菌的感染。研究方法:1、BvrR基因的PCR扩增。获取PCR扩增模板,20μL反应体系中用引物P1、P2进行PCR扩增。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。2、原核表达载体pET28a-BvrR的构建。BvrR基因与载体pET-28a连接。将连接产物转化BL21（DE3）感受态细胞,提取重组质粒pET28a-BvrR。3、原核表达载体pET28a-BvrR表达产物的Western blotting分析。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。4、真核表达载体pcDNA-BvrR的构建。BvrR基因与载体pcDNA连接。将连接产物转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒pcDNA-BvrR。5、真核表达载体pcDNA-BvrR表达产物的RT-PCR及Western blotting分析。使用Simply P总RNA提取试剂盒提取总RNA,采用两步法试剂盒（宝生物公司）进行RT-PCR,按照厂家推荐步骤进行,以引物P2为特异引物进行反转录。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。制备凝胶板,进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据凝胶面积按1-2 mA/cm2,接通电源进行转印。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。6、pcDNA-BvrR核酸疫苗免疫BALB/c小鼠。pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA3.1对照组分别于后肢腿部胫前肌注射浓度为1μg/μL的pcDNA-BvrR质粒和pcDNA3.1质粒,每只小鼠注射100μg质粒。PBS对照组注射PBS 100μL间隔2周后再次注射,共免疫3次。7、ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体及细胞因子。采用ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体及抗体亚类IgG1和IgG2a的水平,检测小鼠血清中IFN-?、IL-4的含量,以确定pcDNA-BvrR核酸疫苗的免疫效果。8、MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖。9、流式细胞仪检测小鼠T细胞亚类（CD4+、CD8+）。10、攻毒保护试验确定疫苗保护率。将第3次免疫后一周的pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA对照组小鼠后肢胫前肌注射100μL浓度为2×106活菌/μL的布鲁斯菌S19株。在注射布鲁斯菌S19株后第14天后进行无菌取脾脏,平皿中放2ml灭菌生理盐水,将脾脏研磨均匀,接种到布鲁斯菌选择性培养基,37℃,5%CO2培养,计算菌落数。结果:1、采用PCR方法扩增了BvrR基因。2、构建了原核表达载体pET28a-BvrR,表达产物经SDS-PAGE电泳检测及Western blotting分析为BvrR融合蛋白。纯化的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。3、构建了真核表达载体pcDNA-BvrR,经RT-PCR及Western blotting鉴定,真核表达载体pcDNA-BvrR可以在真核细胞中表达。4、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体。5、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以增强小鼠IFN-?的分泌,刺激小鼠淋巴细胞的增殖,使脾细胞中CD4+和CD8+T细胞亚类数量显著增多。6、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。结论:1、原核表达的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。2、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体,激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。3、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR产生了一定的免疫保护性。