听皮层是处理听觉信息的高级中枢,其功能对于动物感知危险声音信号以及人类听觉认知和语言沟通等都十分重要。双侧听皮层功能障碍会严重损害听觉认知,在临床上表现为中枢性耳聋及失语,在动物上损毁该区域也会使动物丧失听觉认知能力。听皮层依据其结构功能可划分为若干功能亚区,且亚区数量随动物大脑复杂程度的提高而增加。其中,初级听皮层(the primary auditory cortex,A1)和听皮层前区(anterior auditory field,AAF)是两个主要的听皮层功能亚区,二者共同构成了听皮层的核心区(core region)。听皮层核心区接收来自丘脑的信息输入,是听觉信息进入皮层的第一站。已有的研究表明,听皮层核心区在听觉信息处理中扮演了非常重要的角色,参与了诸如音源定位、声信息提取等重要的听觉过程。因此,研究听皮层核心区神经元的基本信息编码特性,是我们理解听觉信息在皮层中的处理过程的基础。以往的听觉电生理研究受限于研究手段,很难在活体条件下准确分离皮层单个神经元的反应,随着近年来在体膜片钳技术的发展,使我们得以应用松散膜片钳技术准确的记录单个神经元的声音响应,并可以在同一皮层区域得到多个邻近神经元的反应。而在体全细胞膜片钳的应用,则为我们揭示了神经元的兴奋性及抑制性输入的反应特性,桥接神经元的输入与输出。听皮层核心区神经元对声音信息的编码特性依赖于动作电位的发放,为探索其信息编码的特性,我们试从单细胞反应,细胞群体反应,以及皮层间的相互作用三个不同的层面展开研究,并提出了以下4个问题:1、单个神经元是否能够稳定地放电,实现信息的准确传递?2、单个神经元在不同声强下其频率选择性是否保持一致?3、对处在同一皮层位置的神经元群体,相邻神经元的频率选择性差别多大?4、皮层亚区之间是否能互相影响频率选择性?为回答以上问题,我们应用在体细胞外多单位放电记录技术、在体松散膜片钳记录技术、在体全细胞膜片钳记录技术及免疫组织化学技术及光遗传学技术,对以上问题进行了研究,并探索产生这现象的突触基础。1、听皮层神经元反应的不稳定性及其突触机制听皮层神经元对单音反应具有二进制编码(binary coding)的特征,即一个单音刺激通常只能诱发0或者1个动作电位。能否稳定的诱发这“1”个动作电位则决定了是否能够稳定地编码此声音信号。但有研究发现,同一神经元对重复给予的同一声刺激的放电反应并不稳定:在某几次刺激时,会发现放电反应缺失,放电时间也有快有慢,这种现象称为神经元反应的不稳定性(variation)。反应不稳定性的存在很大程度上影响了神经元对信息的准确编码,但在听皮层核心区,这种不稳定反应的程度如何,研究尚不明确。更重要的是,是何种机制导致了皮层神经元产生了如此不稳定的反应,尚待进一步探索。已有研究提出导致神经元不稳定性产生的因素包括内在和外在两类,内在因素包括放电阈值和静息膜电位的波动,但是发现这些因素还不足以解释放电不稳定性的产生。最近有研究发现,操纵突触前神经元的活动可以影响皮层神经元的反应稳定性,提示突触输入可能对反应稳定性有重要影响。结果:我们研究了大鼠A1第4层(layer 4,L4)单个神经元在其最适宜刺激处反应的稳定性,发现(1)即使给予最适宜刺激,大多数兴奋性神经元仍具有较高的放电及时间不稳定性。(2)通过比较阈值,静息膜电位和感觉刺激诱发的突触后电位(PSP)对于反应不稳定性的贡献,我们发现PSP对反应不稳定性的影响最为显著。(3)同一重复刺激能稳定地诱发突触输入,但每次突触输入的幅度却可以有较大变化,且兴奋性输入的幅度变化远远高于抑制性输入。(4)突触输入潜伏期的波动比其整合时间的波动小得多,主要是整合时间决定了皮层神经元放电时间维度的精确性。(5)利用数学建模,我们证实,兴奋性输入的幅度波动可以很大程度上影响放电的不稳定性,而兴奋性输入的时间波动可以很大程度影响最终放电的时间波动。(6)只有兴奋性神经元的反应稳定性与其频率反应特性相关,抑制性神经元则并不具有这一特性。2、声强提高对频率选择的双向影响及其突触基础在人类听觉心理学的研究中早已发现,声强增强能够使得一个纯音听起来调变高或者变低,这提示频率和声强的感知不是互相独立的。也有在基底膜上的研究提示,声强对频率的影响自外周听觉系统就产生了。最近有研究在安装了助听器的患者上也观察到类似听觉心理学现象,但是这些患者外周听觉系统反应的波峰是由所埋入电极决定的,理论上不应发生偏移,这提示声强提高对频率造成的偏移可能不单单由基底膜造成。同时,在听觉上行通路中,多级皮层下核团都参与了对于声音信息的处理,声强对频率偏好的影响是否也存在于听皮层核心区神经元,以及这一特性是如何表现在皮层神经元的反应特性中,还尚未清楚。结果:(1)无论是在清醒或是麻醉状态下的大鼠,神经元群体和单个神经元的最佳频率(Best frequency,BF)都会随着声强的增加而发生显著偏移。(2)这种偏移具有双向性:若神经元的特征频率(characteristic frequency,CF)低于32kHz,那么其BF随着声强的增加向更低频偏移;若神经元的特征频率高于32kHz,那么其BF随着声强的增加向更高频偏移。(3)这种系统性的双向偏移能够影响到听皮层听觉拓扑图(tonotopic map)的分布情况:更高的声强的情况下(阈值以上30分贝),高频区和低频区的面积会扩大。(4)兴奋性和抑制性突触输入的BF均发生了类似的偏移,提示这种偏移是由丘脑继承而来的,而非由皮层内环路产生。3、邻近神经元频率选择多样性的研究及其突触机制尽管在大尺度的研究上,已经知道频率选择性相近的神经元由于接受相似的丘脑输入,位于皮层内的相邻位置,并因此构成听皮层的音频拓扑结构,但在对神经元个体的频率选择细节,及相邻神经元的频率选择共性上,还有许多问题值得探讨。在最近的研究中,利用双光子钙成像技术和双光子引导下的松散膜片钳记录,发现即使是同一层内的邻近神经元,其BF也存在着不同,且这种反应的多样性在L2/3神经元中比L4神经元更为明显,提示这种反应的多样性可能在不同层的神经元中存在差别。目前大多数对听皮层细胞反应多样性的研究是以A1为研究对象,而对于听皮层核心区的另一个组成部分AAF,细胞反应是否也存在上述的多样性还不清楚。更为重要的是,细胞反应多样性是由何种突触机制产生尚待研究。结果:我们以大鼠的AAF为研究对象,发现(1)L4的邻近神经元反应具有很高的相似性,而L5的邻近神经元却具有相当多样的反应。(2)L5神经元接收的兴奋性和抑制性输入在频率选择性上存在错配,且错配程度在不同细胞间存在差异。(3)这种错配的根源是兴奋性输入的频率调谐存在不同程度的偏态分布,而抑制性输入却总是正态分布且相对缺乏变化。(4)对于L4神经元,兴奋性和抑制性输入的BF总是近似的,且均呈正态分布。(5)兴奋与抑制的错配程度与频率选择的多样性呈现高度的正相关。4、A1对同侧AAF神经元的声诱发反应的作用在听皮层核心区中,对A1已有相当深入的研究,但对AAF的研究还相对不足。以往的研究发现,A1和AAF均具有清晰的音频拓扑结构,且二者的频率梯度呈镜像排布,有研究认为这两个区域属于平行的听觉通路。大量研究发现在其他感觉系统,如视觉皮层和体感皮层中,各皮层功能亚区间存在相互作用。然而,目前对于A1和AAF之间的功能关系还了解不够全面。在猫中发现,使用可逆性冷冻皮层的方法使AAF失活可以抑制同侧A1的声诱发反应;听觉皮层(包括A1和AAF)失活可以调节对侧AAF的反应。然而,关于A1如何影响同侧AAF中的神经元反应几乎没有明确的报道。随着近年来光遗传学技术的发展,使我们可以更容易且可逆地调控A1的神经元活动,并可以借助腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)特异性感染某一类型的神经元,从而更精准地研究A1及AAF之间的相互关系。结果:(1)我们在大鼠上功能定位了A1和AAF的位置,并在此基础上使用光遗传学方法在体操纵了A1兴奋性神经元的活动。我们发现,激活A1可以增强AAF神经元的声音诱发活动,降低强度阈值并拓宽频率反应带宽,但不改变其BF,而抑制A1则可以导致相反的作用。(2)我们基于对A1和AAF的精确功能定位,分别应用顺行及逆行性示踪方法,发现A1的兴奋性神经元具有到同侧AAF的直接投射。(3)利用光遗传学方法激活AAF中A1轴突终端却并没有增加AAF的兴奋性,提示这种兴奋效应可能不依赖于同侧的皮层间直接投射。综上,我们的研究从单细胞反应、细胞群体反应和皮层间互相影响的不同角度,探讨了听皮层神经元的信息编码特性,并首次报道了听皮层神经元反应不稳定性及多样性产生的突触基础,为加深对听皮层核心区的功能认识以及了解听皮层环路的信息编码机制提供了有益的实验基础。