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单纯疱疹病毒2型(Herpes simplex virus-2，HSV-2)是人类最常见的性传播病毒之一，它的无症状排毒帮助了它在人群中的大量传播。据世界健康组织(WHO)统计，2012年世界范围内15-49岁人口中有超过4亿人感染HSV-2。HSV-2在青少年及成年人中主要引起复发性的生殖器疱疹，新生儿感染致死率高，另外它还极大地增加了感染HIV的几率。HSV感染人体后建立潜伏感染，使人终生携带，不能治愈。目前可供医疗机构普遍使用的HSV-2特异性诊断试剂非常匮乏，尚无安全有效的疫苗和药物能防治HSV-2感染，最常用的治疗生殖器疱疹的阿昔洛韦等核苷类似物抗病毒药不但药效时间短，更重要的是已经导致病毒耐药性的产生。因而迫切需要我们加深对HSV感染及复制机制的了解，研发出用于HSV诊断及治疗的新型方法及药物。gD是HSV包膜的主要糖蛋白，在促进病毒和细胞融合，介导病毒胞间扩散、释放中具有重要作用。同时gD是HSV主要的免疫原，能诱导体液和细胞免疫。本研究中，我们制备了多株特异性强、灵敏度高的gD单克隆抗体，可用于HSV诊断试剂盒的研制。其中，筛选出一株具有高效中和HSV-1和HSV-2活性的单克隆抗体m27f，它能有效抑制HSV cell-to-cell的传播方式，在动物体内可以有效保护小鼠免受致死性HSV-2的感染所导致的死亡，具有潜在的临床应用价值。确定了m27f所识别的抗原表位是gD蛋白的292-297位氨基酸(amino acid,aa)，推测m27f中和作用的机制是影响了pro-fusion domain的功能，使gD不能激活膜融合复合体，最终导致膜融合过程不能发生。本论文将从以下四章分别进行论述。 第一章:文献综述。简要介绍了HSV-2的病毒结构、感染周期、致病性、潜伏感染及复发。重点介绍了HSV入侵细胞的过程、gD蛋白的结构及其在HSV入侵过程中发挥的作用。另外对HSV-2疫苗及抗病毒药物研究进展、抗体功能及抗体工程研究进展也做了简单介绍。 第二章:针对HSV-2包膜糖蛋白gD的单克隆抗体的制备。以原核表达的HSV-2 gD胞外区蛋白免疫BALB/c小鼠，经过与骨髓瘤细胞融合和单克隆化，获得29株单克隆融合细胞。经酶联免疫吸附(ELISA)、免疫印迹(Western blot)和免疫荧光(Immunofluorescence assay, IFA)三种检测方法，发现29株单克隆融合细胞中的25株对变性条件及天然状态下的gD蛋白都具有良好的识别活性。其中8株能有效中和HSV-2对Vero细胞的感染。将gD胞外区截短为头尾重叠的7段，通过Western blot的方法检测这些细胞上清识别的抗原区段，确定其中15株(28A5、28G4、25D3、27F12、27H9、27F3、27E1、24H9、28H10、28G3、24G1、24B3、24B7、26C10、24E4)识别的抗原表位位于gD278-318aa，该区域位于gD蛋白的pro-fusion domain中;其中10株(23A11、21F12、22D8、25E6、21C11、21A8、21D12、22G10、22H7、22A9)识别的抗原表位主要位于抗原gD1-55aa与gD35-95aa重叠的部位，并且更靠近gD35-95aa的区域里，该区域位于gD蛋白的受体结合结构域。由此可见，我们获得了两类抗体，一类识别靠近gDC端的pro-fusion domain，另一类识别gD N端的受体结合区域。 第三章:中和抗体(m27f)的鉴定及保护效果评估。通过5-RACE的方法获得了具有中和活性的8株单克隆抗体的可变区基因序列，发现它们为同一克隆株，统一命名为m27f。通过Western blot和IFA进一步证实m27f对HSV-1和HSV-2的变性及天然状态下的gD蛋白都具有良好的识别活性。中和实验表明，m27f不但可以高效中和HSV-1和HSV-2病毒，同时它还能抑制HSV-1和HSV-2以cell-to-cell方式传播的活性。通过预防药效测试和治疗药效测试实验证明，m27f可以完全免除致死性HSV-2感染所导致的小鼠死亡。通过分别从N端和C端截短的方法，确定了m27f所识别的抗原表位是gD蛋白的292-297aa，这段区域位于pro-fusion domain中的重要位置，包含了P292和W294等重要位点，因而推测m27f中和作用的机制是影响gD pro-fusion domain的功能，使gD不能有效激活膜融合复合体，进而使病毒失去感染能力。 第四章:中和抗体m27f的抗体工程改造。将m27f的鼠源可变区序列插入到含有人源抗体恒定区序列的真核表达载体上，构建嵌合抗体c27f。利用ELISA的方法证明c27f保留了对gD蛋白的识别活性;通过overlapping PCR以一段柔性肽段将m27f的轻重链可变区序列相连，构建单链抗体，对原核表达的单链抗体进行免疫斑点印迹检测(dot blot)，发现其能特异性识别HSV-2病毒粒子。 第五章:总结与讨论。对单克隆抗体的制备与鉴定、m27f体内与体外抗HSV感染效果评估、m27f的表位鉴定及可能的中和作用机制以及抗体工程改造进行总结，并对本研究所制备的单抗的应用前景进行了讨论。