背景：胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是2型糖尿病、冠心病、高血压等慢性疾病的共同机制及危险因素。有研究发现创伤应激等条件下,机体亦表现出一定程度的胰岛素抵抗并直接影响大手术、创伤的预后。近年来,胰岛素抵抗与缺血再灌注相关性的研究逐渐成为新点、热点之一,有研究证实肝脏缺血再灌注后存在高血糖现象,其产生机制众说不一：Zanaro NL[3]认为是肝缺血再灌注过程中所产生的炎性细胞因子（如TNF-a等）继发性地诱导内源性儿茶酚胺、皮质醇和胰高血糖素等抗胰岛素激素分泌引起的结果；Choi CS[4]认为是恢复血流前使用大剂量类固醇激素所致；Nowsk G[5]认为是肝脏贮存的肝糖元分解、集中释放所致。胰岛素抵抗包括受体前、受体、受体后三个水平,受体前水平IR主要与在体各种抵抗激素的释放有关,而受体及受体后水平IR主要与胰岛素-胰岛素受体（insulin receptor,IR）-受体底物（IR substrates,IRSs）-PI3-kinase-蛋白激酶B（phospho-Protein Kinase B,PKB/AKT）信号系统有关。有研究显示,此信号系统任何靶蛋白分子表达下降均可以引起胰岛素抵抗。胰岛素受体锚定在细胞膜上,细胞膜流动性及结构的破坏势必会损害细胞膜功能,进而影响胰岛素受体表达。因此,同步检测培养基中残余葡萄糖含量,反映细胞膜改变的Annexin-V表达、细胞形态学改变、细胞增殖抑制率变化等指标,有可能在一定程度上反映出细胞是否出现受体水平的胰岛素抵抗现象。胰岛索受体由α、p各两个亚基组成,其中p亚基是发挥胰岛素细胞膜与细胞内效应的功能单位,因此该指标是反映受体水平胰岛素抵抗的特异性敏感指标。AKT时胰岛素信号通路上的关键信号分子,它的磷酸化可激活葡萄糖转运子,进而启动葡萄糖由膜外向膜内转运,因此,通过在检测上述指标同时,同步观察P-AKT的表达变化可以反映出受体后水平的胰岛素抵抗现象。本课题组前期动物实验研究已初步证实,大鼠肝缺血再灌注时,可出现受体前水平的胰岛素抵抗现象（论文待发表）。肝脏的缺血再灌注损伤本质上主要是因缺血缺氧、脂质过氧化自由基大量生成造成的肝实质细胞遭受过氧化损伤,离体肝实质细胞在过氧化损伤时是否存在胰岛素抵抗现象尚有待进一步证实。为证实过氧化损伤是否确实会引发肝细胞出现胰岛素抵抗现象,以及其发生机制,本课题试图在体外实验中利用过氧化氢（H202）处理人正常肝细胞（L02细胞）制作过氧化损伤模型,观察L02细胞在遭受过氧化损伤时过氧化损伤指标丙二醛（MDA）、胰岛素抵抗指标培养基中残余葡萄糖、凋亡指标膜联蛋白V （Annexin5）表达、细胞的生存率及细胞形态学的变化、InsRβ及AKT的表达,证实L02细胞过氧化损伤时是否存在受体及受体后水平葡萄糖利用障碍的胰岛素抵抗现象,初探其可能机制,为临床上防治缺血再灌注损伤提供新思路。材料和方法：1.材料：L02细胞购自中国典型培养物保藏中心（武汉）,过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司,Dmem/High Glucose培养基和改良型RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；批次号：110311；胰酶购自Amresco,货号：0457；葡萄糖测定试剂盒购自上海名典生物工程有限公司；丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。2.细胞培养：①培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时进行传代。②吸弃原有培养基,加入2ml的PBS清洗细胞后弃掉。③加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）,消化1-2分钟。④细胞都变圆后吸出胰酶终止消化。⑤加入3ml的完全培养基,移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。⑥把细胞传到3个相同规格的培养瓶中,置于37℃,5%C02培养箱中继续培养。⑦以生长稳定的3-5代细胞制备细胞悬液,接种于6孔板,每孔细胞数约为5×105个,用于实验。3.实验分组：实验设3组：①A组：L02细胞正常培养24h不加H2O2处理,②B组：L02细胞正常培养24h后力160μmol/LH2O2,③C组：L02细胞正常培养24h后加入517μmol/LH202。分别于0、12、24h收集细胞及上清,采样待测。4.过氧化损伤模型的制作：预实验——用不同浓度的H202作用于L02细胞,Oh、12h、24h后MTT试验计算其抑制率,据结果选取合适的浓度160μmol/LH2O2（24h抑制率为35.8%）、517μmol/L（24h抑制率为50%）用于试验。接种细胞于6孔板,培养24h后,分别加入不同浓度的H202,制作不同程度的细胞过氧化损伤模型。5.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD）检测细胞上清液残余葡萄糖含量：将试剂1与试剂2按4：1比例混合配制成工作液,并平衡至测定温度,每个细胞培养瓶中取10μl上清液加入全自动生化分析仪中。测定培养液残存葡萄糖含量,单位为mmol/L6.硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量：将收集的细胞,4℃冰箱保存,按试剂盒说明用硫代巴比妥酸法检测丙二醛。用紫外分光光度计532nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值,用标准空白管代替测定空白管,MDA含量=测定管吸光度-测定空白管吸光度／标准管吸光度-标准空白管吸光度×标准品浓度／蛋白含量。7. RT-PCR法检测Annexin5的表达：按试剂盒说明书进行操作提取纯化总RNA,用RT-PCR试剂盒检测L02细胞Annexin5表达情况。引物由Invitrogen Biotechnology Co.,LTD中国公司合成,Annexin5的mRNA序列号XM₀01154,其上游引物为：5’-TTATCACCATCTTTGGAACACG-3’,下游引物为：5’-CTTCCTAAACTCCTTCCTGATGT-3’。β-actin的mRNA序列号XM001101,其上游引物为：5’-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’,下游引物为5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’.先以总RNA进行逆转录反应,然后以cDNA为模板采用RT-PCR试剂盒（TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR MixQPS-201）在SLAN荧光定量PCR检测系统进行实时荧光定量PCR反应,反应条件为：95℃预变性1min,95℃变性15s,58℃退火20s,72℃延伸20s,共40个循环,72℃末段延伸5min。扩增完毕后进行溶解曲线分析,采用相对定量法以actin为内参照,利用CT值计算Annexin5mRNA相对表达量：表达量=2-ΔΔCT（△CT=CT目的基因-CT内标基因,△△CT=△CT待测样本-ACT对照样本）。8免疫印迹法（Western Blot）检测胰岛素受体p（insulin receptor β,InsRβ）和磷酸化蛋白激酶B（phospho-Protein Kinase B, PKB/AKT）的表达：反复吹打完全裂解细胞,12000r/min离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。采用Bradford方法测定蛋白质浓度,计算含40μg蛋白的溶液体积即为上样量。采用分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%的十二烷基硫化钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离后进行转膜（PVDF膜在使用之前先用甲醇活化,按照200mA、1h的条件进行转膜）、5%的脱脂牛奶室温封闭30min后分别加入稀释500倍的InsRβ和PAKT抗体,室温下孵育2h,用TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min,将二抗用TBST稀释3000倍,室温下孵育45min,用0.5‰TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min,洗膜后加入二抗孵育。用化学发光法试剂作用后,X线胶片曝光,经显影、定影处理后观察结果。凝胶成像及分析系统扫描图像,以Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值,对样本和内参的比值进行比较分析。9.MTT实验检测细胞抑制率：①将复合材料剪成96孔培养板孔洞大小,用75%乙醇和紫外灯消毒,干燥。放于96孔培养板中1排的2-6孔中。②取调整好密度为5×104/mL的细胞接种于放置材料的孔中,每孔接种0.2ml,即每孔104个细胞。1和7孔加入无细胞培养液提供湿环境。将培养板放入C02孵箱,在37℃、5%C02及饱和湿度条件下孵育24h以贴壁。③待细胞贴壁过夜后,分别加入不同浓度H2O2（0μmol/LH2O2、160μmol/LH2O2、517μmol/LH2O2）,培养24h,同时设不加药的对照组和和只加培养液的调零孔,每个样本浓度设三个重复。④培养相应时间后,取一培养板,每孔加入MTT溶液（5mg/ml）50μl培养箱中继续孵育2h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加200μl DMSO（二甲基亚砜）,震荡10min,将细胞内和细胞周围的MTT-甲穳颗粒充分溶解。⑤选择570nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A）,记录结果,计算平均值,并与对照组进行比较。10.形态学观察：接种细胞于6孔板中,培养24h后,加入不同浓度H202处理,24h后用倒置显微镜观察各组细胞形态。11.统计学方法：所有数据用均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,多组样本比较采用方差分析（组间比较：方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法）,以P<0.05为差异有显著性的判定标准。结果：1.上清液残余葡萄糖含量：A组残余葡萄糖含量自Oh（3.24±0.08）至24h（0.98±0.03）呈一直线下降趋势即与Oh比较有极显著差异（P<0.01）,说明葡萄糖得到较充分利用；B、C组虽亦呈下降趋势,但在12h（2.71±0.08,2.90±0.09）、24h（2.18±0.03,2.34±0.06）两个观察时限点下降幅度B组低于A组（P<0.01）,而C组低于B组。2丙二醛（MDA）含量：0h三组间MDA含量无明显差异,B组MDA含量12h（0.63±0.02）明显增高,至24h（0.72±0.04）继续呈上升趋势,与A组（0.49±0.05）比较有显著差异（P<0.01）；C组在12h（0.71±0.03）其含量陡然上升,不仅高于A组（0.50±0.03）（P<0.01）,而且显著高于B组,但至24h（0.62±0.02）呈下降趋势,略低于B组,但仍高于A组。3. Annexin5的表达：0h三组间Annexin5mRNA的表达水平无明显差异,B组其表达水平12h（2.51±0.07）明显增高,至24h（2.83±0.04）继续呈上升趋势,与A组（1.00±0.00）比较有显著差异（P<0.01）；C组在12h（2.81±0.07）其表达水平陡然上升,不仅高于A组（P<0.01）,而且显著高于B组,但至24h（1.67±0.04）呈下降趋势,略低于B组,但仍高于A组。4. InsRβ、p-AKT表达：在各组间0h及A组各时间点InsRβ、p-AKT表达无明显差异（P>0.05）,B组InsRβ、p-AKT表达12h（0.33±0.02、0.25±0.02）明显降低,至24h（0.2±0.03、0.1±0.02）继续呈下降趋势,与A组（0.47±0.02、0.41±0.04）比较有显著差异（P<0.01）；C组InsRβ、p-AKT在12h（0.2±0.02、0.14±0.01）其表达陡然下降,不仅低于B组（0.33±0.02、0.25±0.02）（P<0.01）,而且显著低于A组（0.47±0.03、0.4±0.09）（P<0.01）,至24h（0.13±0.02、0.06±0.02）继续呈下降趋势,略低于B组（0.22±0.03、0.16±0.02）（P<0.01）,显著低于A组（0.47±0.02、0.41±0.04）（P<0.01）。5.细胞抑制率及光镜下细胞形态：0h三组间抑制率无差异,A组在0-24h抑制率均为0.00%,镜下细胞生长态势良好,贴壁生长,排列紧密,细胞轮廓清楚,形态正常；B、C组抑制率均呈上升趋势,在12h（10.7%,49.3%）、24h（31.1%,59.5%）两个观察时限点抑制率B组高于A组（P<0.05）,而C组高于B组（P<0.05）。B组24h镜下细胞之间空隙增大,形态模糊,可见少量漂浮细胞；C组24h镜下细胞稀疏,可见大量漂浮细胞,折光变弱,细胞质见颗粒存积。结论：本实验结果显示L02细胞在遭受一定程度的过氧化损伤时,MDA增多、细胞抑制率增加、Annexin5表达增强,细胞摄取和利用葡萄糖减少,培养基中残余葡萄糖含量增多,出现葡萄糖利用减少的胰岛素抵抗现象；同时观察到L02细胞过氧化损伤时,发生脂质过氧化,细胞形态发生改变,膜上InsRβ表达减少,提示这种胰岛素抵抗现象与受体表达下降有关,即出现受体水平的胰岛素抵抗现象；另外,AKT的磷酸化在启动受体后葡萄糖的转运起着至关重要作用,实验发现磷酸化的AKT相应地表达降低,提示过氧化损伤不仅可造成肝细胞胰岛素受体水平的胰岛素抵抗,而且可导致受体后水平的胰岛素抵抗现象。总之,这些结果可以为我们在临床上从改善过氧化损伤时受体及受体后水平胰岛素抵抗角度防治缺血再灌注损伤提供新思路。