山羊传染性胸膜肺炎病原的分离及其中国分离株的分子特征分析

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山羊传染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia,CCPP)严重影响亚洲和非洲山羊养殖业的发展,被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。自上世纪末首次分离到CCPP病原并证实该病病原为山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp. Capripneumoniae,Mccp)以来,已经有三十多个国家报道有此病发生,但是仅有十一个国家分离到CCPP的病原体。本实验取临床上疑似感染山羊传染性胸膜肺炎的山羊肺脏,作无菌处理后将匀浆液接种液体培养基培养,当培养液颜色变黄时,涂固体平板培养,挑取单克隆茵落,再接种液体培养基。经过三次克隆纯化后进行生化实验、电镜观察、PCR及酶切鉴定、克隆、测序等基因特征鉴定,分别分析了菌株在三个不同基因片段的同源性,并与Mccp标准株F38、Mmc标准株PG3、MmmLC标准株v-goat、Mbg7代表株N29、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Movi)标准株Y-98进行了遗传进化树分析。结果表明,该病原体在分子特征上属山羊支原体山羊肺炎亚种。将生化实验、电镜观察、基因特征鉴定为山羊支原体山羊肺炎亚种的病原体扩大培养,取第三代培养物(SD3)15ml(10~8CFU/ml)气管接种两只山羊,每日测量体温,观察山羊临床表现。其中一只典型发病,体温升高到41.5℃。ELISA监测IgG,IgM抗体效价明显升高,其中IgG抗体变化与临床表现基本同步。剖杀后的病羊肺组织做显微病理检查,呈现典型的纤维素性胸膜肺炎病变。并从病羊肺中再一次分离到该病病原体。结果表明,本研究分离到的支原体在分类地位上归属于山羊支原体山羊肺炎亚种,人工感染试验进一步证明其为山羊传染性胸膜肺炎病原体。在对CCPP中国分离株87001、87002、1653、367进行分子特征研究中,针对三段基因(A、B、C),对PCR扩增产物进行酶切鉴定和序列测定,将结果与丝状支原体簇的6个成员进行遗传衍化分析。在A片段,4株中国分离株的扩增产物经PstI酶切后的结果与Mccp代表株F38相同,为548bp、420bp、128bp等3条带,其他5个丝状支原体簇成员只有420bp、128bp两条带。在B片段,序列分析结果显示4株中国分离株与F38同源性为99.5%,与山羊支原体山羊亚种Mcc代表株kid的同源性为98.9%,与丝状支原体山羊亚种Mmc ZZ株同源性仅为95.4%。在C片段研究发现,4株中国分离株的序列与Mmc模式株PG3株同源性为67.4%~67.6%,与两株Mcc 8601-50和California Kid同源性为95.1%~98.4%,与三株Mccp 97097ET、Gabes和F38的同源性为99.6~99.8%。通过对中国分离的87001、87002、367、1653等4株CCPP病原体的分子特征研究,首次提出其与山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)亲缘关系最近,应归属为Mccp。首次将国内流行的山羊传染性胸膜肺炎的病原定名为Mccp。
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