橡胶树(Hevea brasiliensis)是世界上种植规模最大的产胶作物,作为天然橡胶的最主要来源,一直是各国研究的热点。其产物橡胶是一种极其重要的工业原料,在很多发达国家都依赖进口。因此,天然橡胶也是一种重要的战略物资。为了阐明橡胶树中橡胶生物合成调控机理,同时为以后高产品种橡胶树分子育种研究打下基础,本研究克隆得到了橡胶合成相关代谢途径(甲羟戊酸途径)中第一个ATP依赖酶-甲羟戊酸激酶(MVK)基因的启动子区序列,结合生物信息学分析方法和转基因技术详细研究了其调控机制,得到研究结果如下。根据橡胶全基因组序列,克隆得到长度为1696bp的橡胶MVK基因启动子区序列,然后提交到启动子在线分析网站进行顺式作用元件的预测。预测与分析结果显示该启动子区序列AT含量高达71.34%,除含有典型的植物启动子核心元件CAAT-box和TATA-box等外,还包含TCA-element和TGACG-motif等激素应答元件、CAT-box组织特异性表达相关元件、Sp1光反应元件等。同时提交分析的还有橡胶合成通路中的其它基因启动子区序列,共预测得到数十个顺式作用元件,发现其中与水杨酸调控相关顺式作用元件TCA-element和茉莉酸调控相关顺式作用元件CGTCA-motif广泛分布于这些启动子区序列中。以克隆得到的HbMVK基因全长启动子区(命名为M5)为模板,根据预测的调控元件位置设计一系列上游引物,共克隆出4种长度的5’启动子区截短片段,长度依次为325bp、725bp、1221bp和1386bp(依次命名为M1 M2、M3和M4)。将连同全长在内的5种长度启动子区序列分别连接于GUS报告基因上游,用农杆菌浸花法侵染拟南芥,筛选得到纯合稳定表达的转基因株系,然后用组织化学染色法和荧光分析法检测GUS基因的表达特性。对转基因拟南芥的GUS活性检测发现M1启动子片段在转基因拟南芥中没有表现出活性,可能原因是M1截短片段缺失了较重要的核心元件。M2截短片段活性是5个片段中最高的(仅次于阳性对照的CaMV35S启动子),而M3、M4、M5活性依次降低,推测HbMVK基因全长启动子区5’端在异源表达条件下可能与反式作用因子存在复杂的相互作用。在对转基因拟南芥的GUS染色中观察到HbMVK基因启动子区全长序列(M5)除在5d苗龄的转基因拟南芥实生苗胚轴中有极微弱表达外,在其它部位和其他苗龄植株上基本上没有表现驱动GUS表达的活性;M4截短片段则可在植株胚轴中观察到较弱的表达活性;M3截短片段在子叶和茎部活性相对较强;而M2截短片段则具有驱动GUS基因在拟南芥所有地面部分表达的活性;M1截短片段却在异源表达情况下基本失去活性。这说明HbMVK基因启动子区可驱动GUS基因在拟南芥中组织特异性和时间特异性表达,但其特异性与其序列长度有关。为了进一步研究外源激素和环境胁迫对HbMVK基因启动子区及其截短片段活性的影响,对全长启动子区片段(M5)和其截短片段(M4)所对应的转基因拟南芥进行相应处理,然后测量其总蛋白中GUS活性在处理前后的变化规律,以期探明上述处理对启动子区片段活性的影响同时验证预测到的调控元件的功能。研究发现乙烯利、赤霉素和低温胁迫会下调M4和M5启动子区片段的活性,而生长素和水杨酸则相反;细胞分裂素对启动子区活性基本无明显影响。通过对比缺失前后启动子区在各种处理下的活性,发现HbMVK基因全长启动子区M5活性几乎在任何处理下都小于M4,即M5启动子区5’端约0.3kb区域的存在具有抑制其活性的作用。推测原因可能是在异源表达条件下该区域与反式作用因子存在抑制性互作所致。