论文部分内容阅读
杆状病毒表面展示(BSD)系统不仅能用于表达外源蛋白,还被广泛应用于基因呈递、基因治疗和疫苗开发等领域。传统BSD的构建是利用“GP64+外源蛋白”融合表达的方式展示到病毒囊膜表面,但由于GP64蛋白在杆状病毒复制的早期就已经开始大量表达,与GP64融合蛋白之间存在强烈的竞争性抑制作用,导致BSD系统展示效率低。研发新型家蚕杆状病毒多基因展示系统(SBMDS),可提高多个目标抗原同时展示在杆状病毒表面的效率,并可用于开发新的动物疫苗载体。PCV2、CSFV和PRRSV是猪疾病的三个重要病原,并研制了相应的亚单位疫苗或者混合疫苗,但三种抗原蛋白的联合疫苗尚未见报道,原因是三种抗原之间的相互作用尚未明确,无法通过物理的方法进行混合制备联合疫苗,而且传统BSD难以实现三个甚至多个外源蛋白的同时表达,制约了利用BSD技术研发联合疫苗的应用价值。论文主要利用SBMDS共表达Invasin蛋白C端截短片段和PCV2、CSFV、PRRSV的主要抗原蛋白Cap蛋白、E2(179)截短片段和GP5蛋白,通过Invasin蛋白C端截短片段可能存在的免疫刺激强化功能,提高PCV2、CSFV和PRRSV免疫水平,并在蛋白水平上检测三种蛋白的表达量和免疫效果。通过分析pcv2、invasin C、e2(179)、gp5基因的密码子偏爱性,解释影响其密码子偏爱性的因素以及密码子偏爱性与基因表达水平的关系,确定提高四种基因在SBMDS中的表达量的策略与方案,获得创新性成果如下:通过Tn7转座和Cre-LoxP同源重组的方式,将pF-p64spFP64-p64sp SI64-phG和pU-p64spCE64-p64spHG64-phM转移载体转入AcMultiBac中,并成功构建了Ac-p64spFP64-p64spSI64-p64spCE64-p64spHG64-phG-phM重组菌株,通过侵染sf9细胞成功获得AcBV-p64spFP64-p64spSI64-p64spCE64-p64spHG64-phG-phM重组杆状病毒。通过SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定证明,Cap-GP64、InvasinC-GP64、E2(179)-GP64和GP5-GP64融合蛋白成功表达并组装在重组杆状病毒表面;间接ELISA实验表明,外源蛋白PCV2-Cap、PRRSV-GP5蛋白比CSFV-E2(179)蛋白有较强的抗原性。通过分析pcv2、invasinC、e2(179)和gp5等四个外源基因的密码子偏爱性,发现蛋白表达量与密码子之间存在一定的联系,并且可以通过优化其密码子的方式来设计最优密码子,以提高其蛋白表达量。论文构建的SBMDS克服了传统BSD展示目标蛋白数量的限制和展示效率低等问题,可高效率展示pcv2、invasinC、e2(179)、gp5等多个外源基因,不仅能发挥其多基因展示的优势,而且还能通过较高量的表达来满足生产需求,有望推动联合疫苗的研发。