研究背景及目的:自噬是机体内维持细胞稳态的重要手段,是细胞内的蛋白质的主要降解途径之一,参与了机体内多种代谢过程,细胞自噬的功能缺陷会引起与衰老密切相关的神经退行性疾病的发生[1]。细胞内自噬的发生受到各种激酶的调控,例如m TOR及AMPK等[2,3]。然而自噬是一个十分复杂的过程,需要机体合成一系列的蛋白,参与自噬的不同反应阶段,对于自噬中多个反应步骤的协调以及自噬相关蛋白的合成,机体需要一个主调节器的存在,而TFEB正是调节自噬关键性的转录因子[4]。TFEB属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子家族蛋白,能够调节许多自噬及溶酶体生成相关基因的转录[5]。TFEB能够结合于自噬相关基因的启动子区,促进自噬小体的生成以及自噬小体与溶酶体的融合过程[4]。在休眠状态的细胞内,营养物质充足,TFEB被磷酸化修饰,处于非活化状态,存在于细胞质内。一旦细胞处于饥饿状态或者溶酶体功能受损,抑制了细胞内激酶的活性,使得TFEB去磷酸化,TFEB就会很快进入细胞核发挥转录作用[4,6]。然而对于TFEB进入细胞核的具体方式,目前还不清楚。Hsp90是一种高度保守的且广泛存在于真核细胞内的伴侣蛋白分子,Hsp90在ATP供能的情况下能够与底物结合,稳定包括一系列自噬相关蛋白在内的多种蛋白的结构及功能,此外Hsp90能够促进多种转录因子进入细胞核,发挥转录功能[7]。已有研究表明了Hsp90在自噬过程中发挥了重要作用,然而对于自噬转录水平的调节研究较少,其具体机制仍有待研究。Cdk5是中枢神经系统内重要的蛋白激酶,应激刺激能够通过调节Cdk5的活性而影响神经元的功能,其中包括了能够引起自噬的饥饿刺激。然而目前对于饥饿引起的Cdk5活性的变化的研究较少,饥饿刺激-Cdk5-自噬调节通路的具体机制仍有待探索。Cdk5是一种脯氨酸定向激酶,它在脯氨酸残基的上游直接磷酸化丝氨酸和苏氨酸[8,9]。序列分析发现,在Hsp90的蛋白序列中存在Cdk5的潜在磷酸化位点。由此提示,Hsp90在Cdk5调节自噬的过程中可能发挥了关键作用。因此本课题的研究目的是探索Hsp90对TFEB入核的调控作用及自噬活性的影响,同时探究Cdk5对于Hsp90的磷酸化作用及其生物学效应,研究在自噬调节通路中Cdk5、Hsp90及TFEB各个分子之间的相互关系,最终找出这些分子通过对自噬活性的调节发挥出的具体功能。研究方法:在本课题的研究中,首先通过免疫印迹实验及荧光显微镜观察RFP-GFP-LC3的表达,检测了Hsp90对于饥饿引起的自噬活性有关键性的调节作用。同时抑制Hsp90后,核浆分离得到细胞核蛋白及细胞质蛋白,免疫印迹检测TFEB的表达变化。荧光素酶报告基因实验检测了Hsp90对TFEB活性的影响,q PCR实验检测了TFEB下游靶基因的转录水平。免疫共沉淀实验及免疫荧光实验检测了Hsp90与TFEB的相互作用。其次,饥饿刺激细胞后,免疫印迹实验检测了Cdk5协同激活因子p35及p25的表达变化,体外磷酸化实验直接检测了Cdk5的磷酸化活性。免疫印迹及荧光显微镜观察RFP-GFP-LC3的表达,探索了Cdk5对自噬活性的影响。再次,体外磷酸化实验及免疫沉淀实验检测了Cdk5对Hsp90的直接磷酸化作用,并通过Hsp90突变质粒的转染发现了Hsp90的具体的磷酸化位点,同时通过核浆蛋白分离、报告基因实验及q PCR实验检测了Cdk5对于TFEB细胞定位及转录活性的影响。最后,使用各种品系的秀丽隐杆线虫,通过荧光实验及q PCR实验检测了Hsp90对TFEB的核定位及转录活性的影响以及Hsp90对自噬的影响。通过线虫寿命实验检测了Hsp90突变对饥饿引起的机体寿命延长的影响。通过不同品系线虫杂交,在Hsp90突变品系线虫内过表达TFEB,线虫寿命实验检测了恢复TFEB活性后,对于机体寿命的影响,此外通过RNAi干扰Cdk5及Hsp90的表达,线虫寿命实验检测了Cdk5对于寿命的影响。研究结果:实验一:Hsp90介导TFEB进入细胞核发挥转录活性(1)通过检测自噬标志性蛋白LC3 II及细胞内自噬流的改变,探索了Hsp90对于自噬的影响。结果发现,抑制Hsp90的表达及功能,能够明显抑制细胞内的自噬活性。(2)探究了Hsp90对于自噬关键转录因子TFEB的细胞分布的影响。结果发现,抑制了Hsp90的表达及功能,能够明显抑制细胞核内TFEB的表达水平。(3)探索Hsp90对于TFEB转录活性的影响。报告基因及q RCP实验结果发现,抑制Hsp90的表达及功能,能够抑制TFEB的转录活性以及抑制TFEB下游靶基因的转录水平。(4)免疫共沉淀结果显示,TFEB能够与Hsp90直接结合,且饥饿刺激能够促进二者结合。同时研究表明Hsp90的中间结构域在这二者的结合过程中发挥了关键作用实验二:激酶Cdk5调节细胞自噬活性(1)免疫印迹实验发现,饥饿刺激导致Cdk5的协同激活因子p35及p25的表达水平明显下降。体外磷酸化实验结果显示,饥饿刺激能够明显降低Cdk5的磷酸化活性。(2)过表达Cdk5及p35,能够明显抑制饥饿诱导的自噬标志物LC3 II的表达,同时抑制自噬流的发生。实验三:Cdk5通过磷酸化修饰Hsp90调节TFEB活性(1)体外磷酸化实验及免疫沉淀实验显示,Cdk5能够直接磷酸化Hsp90。转染Hsp90S595A突变质粒后再检测Hsp90磷酸化水平,结果显示Cdk5不能够磷酸化Hsp90,提示Hsp90 595位丝氨酸是Cdk5的磷酸化位点。(2)Hsp90S595D突变能够使595位点的丝氨酸处于磷酸化状态,Hsp90二聚体实验及免疫共沉淀实验结果显示,Hsp90 595位点的磷酸化能够明显降低Hsp90的二聚体表达水平,同时降低Hsp90与其常见底物蛋白Hsp70的结合能力。(3)过表达Cdk5及p35后,检测TFEB的细胞定位及转录活性。结果显示,过表达Cdk5及p35能够明显降低饥饿诱导的TFEB细胞核内的表达水平,同时降低TFEB的转录活性以及TFEB下游靶基因的m RNA水平。实验四:Hsp90-TFEB-自噬调节通路在机体寿命及神经退行性疾病中的影响(1)使用Hsp90突变品系及野生型线虫,检测了Hsp90对于TFEB及自噬的影响。结果显示,抑制Hsp90能够抑制饥饿引起的TFEB的细胞核定位以及TFEB下游靶基因的转录水平,同时能够抑制饥饿诱导的自噬的发生。(2)抑制Hsp90的功能能够抑制饥饿引起的线虫寿命的延长,同时在Hsp90突变型线虫体内过表达TFEB,寿命试验显示,Hsp90对于寿命的影响是通过TFEB发挥作用的。干扰线虫Cdk5及Hsp90的表达,寿命实验显示,单独干扰Hsp90的表达对线虫寿命没有明显的作用,单独干扰Cdk5的表达能够明显增加线虫的寿命,而同时干扰DAF-21的表达时,线虫的寿命恢复到正常状态。(3)CR能够保护MPTP小鼠模型中中脑黑质区多巴胺能神经元以及纹状体区的多巴胺能神经元纤维,而抑制Hsp90的功能后,CR就会丧失对神经元及其纤维的保护作用。研究结论:通过本课题的研究,首次发现了Hsp90能够协同TFEB进入细胞核发挥转录活性,从而调节自噬的发生。首次发现Cdk5对于Hsp90的磷酸化作用及Hsp90 595位丝氨酸的磷酸化位点,并通过抑制Hsp90的功能调节TFEB的细胞核定位及转录活性,影响自噬的发生。建立了Cdk5-Hsp90-TFEB-自噬调节通路,初步探讨了此通路在延长机体寿命及延缓帕金森病中的重要作用,为延缓衰老及治疗帕金森病提供了新的靶点及治疗策略。