第一部分MAGED4B通过抑制TRIM27使TNF-α凋亡通路失活进而促进胶质瘤的进展【背景】脑胶质瘤起源于神经胶质细胞,是颅内最常见的原发性恶性肿瘤。临床上,胶质瘤的治疗方法主要有手术切除、放疗和化疗等,但患者的治疗效果欠佳,预后差,死亡率高。有研究表明,有效肿瘤标志物的应用有助于肿瘤患者的早发现、早诊断和早治疗,并对患者的预后预测有一定的意义。肿瘤细胞增殖和死亡的比例失衡是肿瘤发生的关键因素,其中细胞凋亡的抑制起到了重要的作用。临床上多数抗肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡发挥作用的。因此研究胶质瘤中发挥重要作用的肿瘤标志物和探索其可能参与的凋亡相关分子机制具有重要的临床价值和意义。MAGED4B属于黑素瘤抗原基因（MAGE）家族,MAGEs在人类多种癌症中都有表达,并通过各种机制驱动肿瘤的进展,导致肿瘤的生长,转移和复发。有报道称,MAGED4B在肺癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌、肝癌等多种癌症中均有高表达,但是在公开文献中鲜见具体关于MAGED4B在脑胶质瘤中的表达作用和其可能参与的凋亡相关机制的研究。【目的】1.检测MAGED4B在胶质瘤组织和细胞中的表达情况,分析MAGED4B与临床各病理特征及患者预后的关系。2.研究MAGED4B基因对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其可能参与调控的凋亡相关分子生物学机制。【方法】1.收集胶质瘤患者的癌组织及其配对的癌旁组织,通过实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,q PCR）、免疫印迹（Western blot,WB）实验和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测组织中MAGED4B分子的表达。分析MAGED4B表达水平与患者临床病理学参数的关系,通过Kaplan-Meier生存曲线探究MAGED4B与胶质瘤患者预后的关系。2.通过sh-MAGED4B慢病毒感染,筛选出稳定敲低MAGED4B的U87细胞株,同时应用瞬时转染实验,构建过表达MAGED4B的胶质瘤细胞。采用CCK-8实验、集落形成实验、EDU实验和流式周期实验探究MAGED4B对胶质瘤细胞增殖的影响;应用Transwell和细胞划痕实验探究MAGED4B对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响;应用流式凋亡细胞技术和TUNEL实验分析MAGED4B对胶质瘤细胞凋亡的影响;通过裸鼠脑原位植瘤实验探究MAGED4B对体内脑胶质瘤细胞生长的影响;通过免疫共沉淀实验、细胞荧光和WB实验来探究MAGED4B对胶质瘤细胞发生发展机制的影响。【结果】1.在8对新鲜的胶质瘤及其相应的癌旁组织中,通过q PCR和WB实验发现,脑正常组织中MAGED4B的m RNA和蛋白表达水平均低于相应的癌组织（P＜0.05）。170例胶质瘤患者的临床资料分析显示,MAGED4B的表达与胶质瘤患者的年龄、肿瘤级别、肿瘤直径和Ki-67表达之间有显著关系（P＜0.05）;由COX回归分析可知高肿瘤级别（P=0.001）和高MAGED4B表达（P=0.006）是胶质瘤患者的独立不良预后因素;通过Kaplan-Meier生存曲线可知,MAGED4B高表达时,胶质瘤患者的预后不良,且差异具有统计学意义（P=0.002）。以上结果表明MAGED4B可能促进了胶质瘤的发生发展。2.通过慢病毒感染技术,构建稳定敲减MAGED4B的U87细胞株;利用瞬时转染技术,在胶质瘤细胞中过表达MAGED4B。由实验结果可知,过表达MAGED4B可提高胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制胶质瘤细胞凋亡,促进胶质瘤细胞对顺铂的化学耐药性。3.使用已筛选好的稳定敲减MAGED4B的U87细胞株和相应的U87空载细胞株,通过裸大鼠脑原位成瘤实验来探究MAGED4B对体内胶质瘤细胞生长的影响。结果表明,MAGED4B敲减组细胞株在裸鼠脑内的生长速度明显低于对照组细胞株。4.在U87细胞中,TRIM27与MAGED4B之间存在相互作用,同时,MAGED4B和TRIM27在U87细胞中存在内源性的共定位。在胶质瘤细胞中,敲减MAGED4B,TRIM27表达升高,同时TNF-α凋亡通路相关蛋白（USP7、RIP1、Caspase8、Caspase3、Cleaved-caspase3）也表达升高。【结论】1.MAGED4B在胶质瘤组织中的表达高于瘤旁正常组织,并且MAGED4B的高表达与胶质瘤级别高、肿瘤直径大、Ki-67水平高和患者年龄大有关;MAGED4B高表达时,胶质瘤患者的预后不佳;MAGED4B是胶质瘤患者的独立预后因子。2.过表达MAGED4B可促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力;抑制胶质瘤细胞的凋亡;增强胶质瘤细胞对顺铂的化学耐药性。3.MAGED4B可通过抑制TRIM27的表达诱导TNF-α凋亡通路失活,进而促进了胶质瘤的发生发展。第二部分多模态MRI与胶质瘤中MAGED4B表达的相关性【背景】我们在第一部分中研究发现了MAGED4B可作为胶质瘤的肿瘤分子标志物。因此,探索可无创性评估MAGED4B表达情况的方法具有一定的临床意义。磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）技术可有效地对脑胶质瘤患者进行无创性评估,相对于常规MRI技术,高级MRI技术可更好地显示肿瘤微观水平的改变。先进MRI成像技术包括:扩散加权成像（diffusion weighted imaging,DWI）、磁共振波谱成像（magnetic resonance spectroscopy,MRS）和扩散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI）等。目前,对MAGED4B和MRI影像学参数相关性的研究未见报道。本研究中,我们通过多模态MRI技术探究了MAGED4B的表达与影像学参数的关系,旨在寻找可无创性评估胶质瘤中MAGED4B表达的影像学标记物。【目的】1.分析在不同病理分级的脑胶质瘤中,MAGED4B的表达与DWI的ADC参数的相关性;探究在胶质瘤中DWI是否可作为评估MAGED4B表达高低的无创性预测工具。2.分析在不同病理级别的脑胶质瘤中,MAGED4B的表达与1H-MRS的Cho/Cr、Cho/NAA和NAA/Cr比值的相关性,探究1H-MRS是否可作为无创性评估胶质瘤MAGED4B表达高低的预测工具。【方法】1.回顾收集来自我院2016年1月至2020年6月期间,经病理证实为脑胶质瘤的患者,共170例。其中男性105例,女性65例,患者年龄的中位值为53.00岁,四分位间距为42.75-64.00岁。2.所有纳入的患者均接受了常规MRI及增强扫描。在常规MRI平扫的基础上,进行DWI和1H-MRS序列的检查。在纳入的170例患者中,其中166例患者进行了DWI序列的扫描;67例患者进行了1H-MRS序列的扫描。将获得的高级MRI图像传到GE ADW4.6工作站,使用Functool软件进行后处理。分别测量DWI图像中肿瘤实质部分和瘤周部分的ADC值,并分别将其与对侧正常脑白质区域的ADC值相比,得出相应区域的r ADC值;对于1H-MRS图像,分别选取肿瘤实质部分和瘤周部分进行测量,得出相应部位Cho/Cr、Cho/NAA和NAA/Cr的比值。瘤周部分选取的范围为肿瘤实质周围15 mm以内。3.采用免疫组织化学技术检测170例胶质瘤组织中MAGED4B的表达水平。运用非参数检验分析各影像学参数与胶质瘤分级及MAGED4B表达水平的关系。运用Spearman等级相关性方法分析影像学参数与胶质瘤级别和MAGED4B表达量的相关性。【结果】1.在胶质瘤患者中,肿瘤实质部分和瘤周部分的r ADC值在低级别和高级别胶质瘤之间有显著统计学差异（P＜0.05）,相较于低级别胶质瘤,高级别胶质瘤肿瘤实质部分和瘤周部分的r ADC值均降低。Spearman相关分析显示,肿瘤实质部分的r ADC值与胶质瘤等级呈显著负相关（P＜0.05）;肿瘤瘤周部分的r ADC值与胶质瘤等级亦呈显著负相关（P＜0.05）。2.不管在胶质瘤实质部分还是瘤周部分,MAGED4B高表达组的r ADC值均低于MAGED4B低表达组的r ADC值（P＜0.05）;通过Spearman相关分析可知,肿瘤实质部分的r ADC值与MAGED4B表达量之间呈显著负相关（P＜0.05）;肿瘤瘤周部分的r ADC值与MAGED4B表达量之间亦呈显著负相关（P＜0.05）。3.不管在胶质瘤实质部分还是瘤周部分,高级别胶质瘤组的Cho/Cr、Cho/NAA值均高于低级别组,而高级别胶质瘤组的NAA/Cr值低于低级别组,以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。通过Spearman相关性分析可知,肿瘤实质部分和瘤周部分的Cho/Cr、Cho/NAA值均与胶质瘤病理等级呈显著正相关（P＜0.05）,而肿瘤实质部分和瘤周部分的NAA/Cr值与胶质瘤病理等级呈显著负相关（P＜0.05）。4.不管在胶质瘤实质部分还是瘤周部分,MAGED4B高表达组的Cho/Cr、Cho/NAA值较MAGED4B低表达组的高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。通过Spearman相关性可知,肿瘤实质部分和瘤周部分的Cho/NAA、Cho/Cr值与胶质瘤中MAGED4B的表达量均呈显著正相关（P＜0.05）。【结论】1.在胶质瘤实质和瘤周组织中,肿瘤的分级越高,r ADC值越低,Cho/Cr、Cho/NAA值越高,NAA/Cr值越低。DWI和1H-MRS可作为术前评估胶质瘤病理分级的无创性预测工具。2.在胶质瘤实质和瘤周组织中,MAGED4B表达越高,r ADC值越低,Cho/Cr和Cho/NAA值越高。DWI和1H-MRS可作为评估MAGED4B表达高低的无创性预测工具。第三部分影像组学联合临床特征术前预测胶质瘤中MAGED4B基因表达【背景】影像组学是基于医学影像的大数据研究,其可从不同维度和层面提取医学影像图像中反映病变内在生物特性的数据,相较于传统的影像研究,可更全面地分析肿瘤的内在异质性。同时,通过机器学习的算法,我们可获得精确的预测模型。目前影像组学已普遍应用于临床研究,其在肿瘤的诊断、鉴别诊断和预后评估等方面均发挥了一定的作用。胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤,其恶性程度高,侵袭性强,患者治疗效果欠佳,术后复发率高,患者的预后差。有效肿瘤分子标志物的应用不仅有助于肿瘤的早期筛查,而且有助于监测治疗效果、指导临床治疗方案和评估患者的预后,但是目前临床上诊断分子标志的方法有创且昂贵。本课题前面的研究为MAGED4B可作为胶质瘤肿瘤分子标志物提供了有力的证据,在胶质瘤中过表达MAGED4B促进了肿瘤的发生和发展。目前,公开文献中未见关于MRI影像组学预测胶质瘤中MAGED4B表达状态的研究,故在胶质瘤中探究可无创性预测MAGED4B表达的影像组学模型具有一定的科学意义。【目的】基于影像组学和临床特征,在胶质瘤中构建可术前评估MAGED4B表达状态的预测模型。【方法】回顾性收集2016年1月至2020年6月期间病理诊断为脑胶质瘤的患者166例,并记录整理患者的临床数据和MRI图像资料。应用SPM12软件对纳入的MRI图像进行配准,采用3D slice软件对胶质瘤图像行三维手动分割,采用python软件的Pyradiomics包对T2加权成像（T2 weighted imaging,T2WI）、对比增强T1加权成像（contrast-enhanced T1-weighted imaging,CE-T1WI）和弥散加权成像（DWI）的表观弥散系数（apparent diffusion coefficient,ADC）图进行预处理和影像组学特征的提取,通过ANOVA分析和LASSO回归分析对提取的特征进行筛选和降维,最终保留最具预测价值的影像组学因子。通过逻辑回归基于三个单独MRI序列及其组合序列构建影像组学模型,应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）对各模型进行评估,以确定最佳的预测MAGED4B表达状态的影像组学模型。采用单因素分析方法挑选出与MAGED4B表达显著相关的临床参数,基于临床指标构建临床预测模型和临床与影像组学整合的预测模型。应用ROC曲线和决策曲线分析法（Decision Curve Analysis,DCA）评估模型的预测效能,绘制最佳模型的列线图,应用校正曲线评估该模型的准确度。【结果】1.通过ANOVA分析和LASSO回归分析,我们最终从ADC图中筛选出7个特征,从T2WI中筛选出7个特征,从CE-T1WI序列中筛选出11个特征,接着联合三个序列,用同样的方法,我们从多参数MRI序列中最终筛选出10个特征。根据ROC曲线分析结果可知,在训练组中,CE-T1WI序列、T2WI序列、ADC图和多参数MRI序列模型的ROC曲线下面积（Area Under Curve,AUC）分别是0.928、0.889、0.895和0.946,在验证组中分别为0.897、0.830、0.879和0.908,在全部病人组中分别为0.918、0.865、0.889、0.931。由以上可知,多参数MRI影像组学模型的预测能力优于单个序列模型。2.基于临床参数,通过逻辑回归分析构建临床预测模型和临床与多参数MRI影像组学整合模型。由ROC曲线分析结果可知,临床模型在训练组、验证组和全部病人组中的AUC值分别为0.684、0.766和0.702,影像-临床整合模型在训练组、验证组和全部病人组中的AUC值分别0.963、0.976和0.954,结合之前的结果,我们发现整合模型的预测效能高于临床模型和单独影像组学模型。DCA曲线分析结果显示,整合模型的临床应用价值最高。基于影像-临床整合模型,我们绘制了列线图,由校正曲线可知整合模型对胶质瘤中MAGED4B高表达的预测概率与实际概率基本一致。【结论】1.通过影像组学分析的方法从多参数MRI序列中提取胶质瘤内在的生物学特征,并建立相应的影像组学预测模型,相较于传统的形态学模型,该预测模型可以更客观、更全面、更准确地评价胶质瘤中MAGED4B的表达状态。2.通过影像组学的方法结合相关临床参数构建临床与影像组学整合模型列线图,该模型具有很高的预测效能和临床价值,可为临床提供一种无创性术前评估胶质瘤中MAGED4B表达水平的方法。第四部分MAGED4B基因结合影像组学参数预测胶质瘤患者术后总体生存率【背景】胶质瘤是脑内最常见的原发性恶性肿瘤。尽管目前临床上针对胶质瘤的诊疗方法取得了很大的进步,但因胶质瘤的恶性程度高、侵袭能力强、复发率高等特点,导致患者的预后往往不佳,其中高级别胶质瘤患者的5年生存率还达不到10%。已知磁共振成像技术可以无创地反映病变组织的内在信息,相比于临床上对病变组织局灶性地取样检查,磁共振成像技术可以全面地反映组织的病变信息,此外基于MRI的影像组学方法可以更深层地提取大量的关于肿瘤内在异质性的定量特征。目前已有许多研究证实通过MRI影像组学方法构建的影像组学模型可以有效地预测肿瘤患者的预后,且相对于单一MRI序列和单一影像组学模型,联合多参数MRI序列影像组学特征和临床预后因素构建的整合模型对患者预后预测的效能更好。在本课题中,我们发现了MAGED4B基因具有促进胶质瘤发生发展的作用,MAGED4B高表达的胶质瘤细胞的增值、侵袭和抗凋亡能力更强,同时MAGED4B可作为胶质瘤患者的独立预后危险因子。故将MAGED4B表达水平纳入临床特征的研究具有一定的意义。因此在胶质瘤中,构建整合MRI影像组学参数和临床特征的预测模型,可能会为患者提供更好的预后预测方法。【目的】基于影像组学参数和患者的临床指标（包含MAGED4B表达水平）,在胶质瘤中构建可评估胶质瘤患者总体生存率的预测模型。【方法】收集154例已经病理诊断的脑胶质瘤患者（2016年1月至2020年6月）的临床数据和MRI影像资料,收集的患者术前均接受磁共振T2WI、CE-TIWI和DWI的检查,对DWI图像进行后处理得到相应的表观扩散系数（ADC）图。使用SPM12软件配准这三种MRI图像,用3D slice软件手动分割胶质瘤病灶的三维图像,使用python软件对三种MRI图像行预处理和影像组学参数的提取,之后应用ANOVA分析和LASSO回归分析对所提取的参数进行降维筛选,采用逐步法COX回归最终选出最具预后价值的影像组学因子,并在此基础上建立影像组学模型,使用Kaplan-Meier生存曲线验证影像组学参数的预后预测能力。通过单因素和多因素分析在临床特征中筛选胶质瘤患者的独立预后因子。最后整合影像组学特征和临床特征构建预后预测模型,绘制预测模型列线图。应用ROC曲线对每个模型的预测能力进行评估,应用校正曲线评估整合模型的准确度。【结果】通过ANOVA分析、LASSO回归分析和逐步COX回归分析最终从多参数MRI序列中选择出11个影像组学特征,其中来自CE-T1WI序列的有4个,来自ADC图的有5个,来自T2WI序列的有2个。通过Kaplan-Meier生存曲线结果可知,无论在训练组、验证组还是全部病人组中,影像组学特征均与患者的总体生存率（Overall Survival,OS）显著相关（P＜0.05）,且相较于低风险组,高风险组患者的OS显著降低。对临床特征行单因素和多因素分析,结果表明,肿瘤强化（P=0.043）、病理分级（P＜0.001）、及MAGDE4B表达水平（P=0.047）是胶质瘤患者OS的独立预后因子。基于影像组学特征和临床特征分别构建影像组学模型、临床模型和影像组学与临床的整合模型。通过ROC曲线可知,无论是对患者1年还是3年OS的评估,临床与影像组学整合模型的预测效能均高于单一模型。之后基于整合模型绘制预测模型列线图,通过校正曲线可知整合预测模型对胶质瘤患者OS的预测概率与实际概率基本一致。【结论】通过影像组学方法筛选的多参数MRI影像组学特征与胶质瘤患者的OS显著相关（P＜0.05）;基于临床特征和影像组学特征构建的临床与影像组学整合模型表现出最佳的预后预测价值,其对胶质瘤患者术后总体生存率的预测能力均高于临床模型和单独影像组学模型。在胶质瘤中,通过绘制整合模型列线图,我们可获得一种无创的和廉价的评估胶质瘤患者总体生存率的手段。