【摘 要】
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背景:去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes,DUBs）是一类数量庞大的调控蛋白质泛素化水平的酶,主要是将泛素化的靶蛋白上的泛素分子移除从而调控蛋白质的稳定性以及信号转导。因此去泛素化酶对于维持细胞内蛋白质稳态平衡,调节细胞蛋白功能,发挥着重要的作用。研究表明DUBs蛋白自身也会受翻译后修饰影响,其中包括泛素化修饰。然而关于DUBs是否会调控自身的泛素化及其作用机制依然有待进
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背景:去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes,DUBs）是一类数量庞大的调控蛋白质泛素化水平的酶,主要是将泛素化的靶蛋白上的泛素分子移除从而调控蛋白质的稳定性以及信号转导。因此去泛素化酶对于维持细胞内蛋白质稳态平衡,调节细胞蛋白功能,发挥着重要的作用。研究表明DUBs蛋白自身也会受翻译后修饰影响,其中包括泛素化修饰。然而关于DUBs是否会调控自身的泛素化及其作用机制依然有待进一步的研究。目的:本文旨在利用去泛素化酶及相应酶活突变体的基因表达文库来寻找一些会调节其自身蛋白水平稳定性的去泛素化酶,并初步研究去泛素化酶自我泛素化调控的机制。方法:1.设计DUBs酶活突变的克隆引物,利用PCR技术扩增目的基因,建立去化素化酶酶活突变体的基因表达文库;2.将构建的去泛素化酶及其酶活突变的基因表达文库的质粒利用脂质体EL转染技术分别转染到MCF7细胞中,转染40-48小时后裂解提取蛋白,利用Western-blot技术检测和筛选DUBs酶活突变导致自身蛋白水平下降的基因;3.将上述筛选到的DUBs基因所对应的酶活突变体分别与对应的野生型DUBs或对照质粒通过转染试剂EL共转染至MCF7细胞中,收集蛋白,western blot检测,发现11个DUBs会上调对应酶活突变体的蛋白表达水平;4.上述发现的候选基因中,我们发现USP26,USP29和USP37在进化上具有一定的同源性,因此我们重点研究该家族。我们将研究USP26,USP29和USP37对各自酶活突变蛋白自身稳定性的影响,它们是否存在同源自我相互作用,以及它们是否发生自我去泛素化;5.以USP29为例,研究调控USP29蛋白稳定性的结构域,以及USP29调控自身蛋白稳定性的具体机制。结果:1.成功构建了含有47个去泛素化酶酶活突变基因的表达文库。2.利用去泛素化酶及其酶活突变体的基因表达文库筛选发现13个DUBs酶活突变后会使其自身蛋白水平下降。3.11个去泛素化酶存在自我稳定。4.USP37家族在细胞中发生泛素化降解。5.USP37家族通过同源自我相互作用来稳定其酶活突变体的蛋白表达水平。6.USP26,USP29和USP37亚家族成员的自我去泛素化。7.USP26,USP29和USP37亚家族成员延长其对应蛋白酶活突变体的半衰期。8.USP29的N端结构域不稳定。9.USP29能使USP29 N端结构域变稳定。10.USP29通过N端结构发生相互作用,且N端结构可发生自我相互作用。11.USP29 N端结构域在MCF7细胞中发生泛素化降解。12.USP29 N端结构域主要发生K27泛素化修饰。结论:我们筛选了含有47个的去泛素化酶及其酶活突变体的基因表达文库,发现一些去泛素化酶会依赖其催化活性及通过同源自我相互作用的方式来调节自身蛋白的稳定性。以USP29为例,我们发现USP29自我去泛素化从而提高自身蛋白稳定性。进一步的实验研究表明,USP29的N末端区域是其不稳定、发生降解的关键结构域,并会进行K27修饰的泛素化降解。综上所述,我们的工作揭示了一些去泛素化酶存在调节自身的泛素化和蛋白质稳定性的现象,为去泛素化酶的多样性调控机制提供了新颖的分子见解。
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