免提取TaqMan探针法qPCR技术具有省时、高效、准确的优势,在临床快速诊断和食品快速检测都具有广泛的应用前景。TaqDNA聚合酶作为PCR检测试剂的核心组分,不仅需要有耐受不同样品中抑制剂的能力,还需要具备水解TaqMan探针的能力。然而,兼具以上两种性能的DNA聚合酶稀缺。因此,对TaqDNA聚合酶进行分子改造,并将其应用到免提取TaqMan探针法qPCR中具有重要意义。本文在突变体Sso7d-Taq（Δ289）（STaq）基础上,应用基因工程技术对其进一步改造,获得新的突变体pFEN1-STaq。在研究了pFEN1-STaq的酶学性质之后,进一步采用化学修饰的方法实现了pFEN1-STaq的热启动,并将热启动pFEN1-STaq应用到免提取TaqMan探针法qPCR中。主要研究内容及结论如下:（1）TaqDNA聚合酶的分子改造。设计并合成了pfen1基因,通过同源重组的方式成功构建了用于原核表达的p ET-28a-pfen1-staq重组质粒,并实现了pFEN1-STaq重组蛋白在原核系统中的可溶表达。优化了原核表达pFEN1-STaq重组蛋白的条件:诱导表达温度18℃、诱导表达时间12 h、诱导剂IPTG终浓度为0.1 mmol/L。采用镍离子金属螯合亲和层析的方法对pFEN1-STaq重组蛋白进行分离纯化,发酵3 L培养基共纯化得到5.4 mg重组蛋白pFEN1-STaq。（2）pFEN1-STaq的酶学性质研究。建立了pFEN1-STaq的聚合酶活性及5’-3’核酸外切酶活性测定体系,同时研究了缓冲液中不同组分对pFEN1-STaq两种活性的影响,发现pH值为8.8和低盐浓度下pFEN1-STaq聚合酶活性较强;而且,高MgSO4浓度有利于其发挥5’-3’核酸外切酶活性。pFEN1-STaq热稳定性好,且其聚合酶活性的热稳定性优于5’-3’核酸外切酶活性的热稳定性。pFEN1-STaq的最适延伸温度为68℃,延伸速率可达3000-4000 bp/s。pFEN1-STaq耐受抑制剂能力较强,至少能耐受浓度为1.0 U/m L的肝素钠、2.5μg/μL的黄芪多糖、5.0 ng/μL的腐殖酸以及40%（v/v）全血。（3）热启动pFEN1-STaq的制备及性质研究。优化了柠康酸酐化学修饰制备热启动pFEN1-STaq的条件:柠康酸酐与pFEN1-STaq反应摩尔比为2500:1、反应温度37℃、反应时间4 h、反应pH值为9.0。优化了热启动pFEN1-STaq的热激条件:热激温度95℃、热激时间10 min。化学修饰后的pFEN1-STaq相较于修饰前,虽然聚合酶活性损失了约80%,5’-3’核酸外切酶活性损失了约85%,但扩增特异性和扩增灵敏度都有显著提高。（4）热启动pFEN1-STaq在免提取TaqMan探针法qPCR中的应用。基于热启动pFEN1-STaq建立了免提取TaqMan探针法qPCR体系,优化了1×缓冲液组成为:10mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L KCl、5 mmol/L（NH4）2SO4、6 mmol/L MgSO4、0.05%（v/v）Triton X-100,pH 8.3;探针浓度为0.30μmol/L;热启动pFEN1-STaq添加量为2.5 U;退火、延伸温度为60℃。所建立的免提取TaqMan探针法qPCR体系测试样本可耐受的全血最大添加量为8%（v/v）,并且可实现8%（v/v）全血含量以内样本的定性和定量检测。该检测方法稳定性良好,灵敏度和特异度高,在8%（v/v）全血含量下的最低检测限为10-100 copies/μL。