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目的探讨p53对胶质瘤相关基因MAGE-D4的转录调控作用。方法1.生物信息学分析:利用MatInspector在线软件分析MAGE-D4核心启动子区转录因子p53结合位点。2.p53缺失胶质瘤细胞模型的构建:CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除胶质瘤细胞(U87MG和A172)的野生型p53(Wtp53)基因,并通过三方面进行敲除后验证:(1)p53基因测序验证;(2)p53基因表达验证;(3)通过检测p53下游功能靶基因p21蛋白了解p53功能失活情况。3.p53突变胶质瘤细胞模型的构建:将p53基因第248和175位氨基酸点突变的p53慢病毒表达载体(Lvp53Mt248和Lvp53Mt175),稳定转染U87MG-p53KO和A172-p53KO细胞,并通过两方面进行突变验证:(1)p53基因表达验证;(2)通过检测p53下游功能靶基因p21蛋白了解突变型p53功能情况。4.MAGE-D4表达检测:提取不同p53状态的U87MG和A172细胞总RNA和蛋白,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blot)法检测MAGE-D4 mRNA和蛋白表达情况。5.MAGE-D4启动子活性测定:根据生物信息学分析结果,构建含有或缺失潜在p53结合位点的MAGE-D4核心启动子双荧光素酶报告基因载体,转染不同p53状态的U87MG和A172细胞,通过检测荧光素酶活性,了解MAGE-D4启动子活性。结果1.MAGE-D4核心启动子区含p53结合位点:生物信息学分析显示,MAGE-D4核心启动子区(-358～+172 bp)存在一个潜在的P53结合位点(+59～+83bp)。2.成功构建p53缺失的胶质瘤细胞模型(U87MG-p53KO和A172-p53KO):CRISPR-Cas9技术敲除U87MG和A172中p53wt后,DNA测序证实p53基因发生了预期的p53 DNA片段缺失;U87MG敲除后p53 mRNA表达显著减少,p53蛋白表达缺失;A172敲除后p53 mRNA和蛋白几乎检测不到;同时二株细胞随着p53基因的敲除,p21蛋白表达随之降低,其中U87MG敲除后p21蛋白下降更为明显。3.成功构建p53突变的胶质瘤细胞模型(U87MG-p53Mt和A172-p53Mt):p53Mt248和p53Mt175慢病毒表达载体高效转染U87MG-p53KO和A172-p53KO细胞后,均出现明显的p53蛋白表达条带;同时引起p21蛋白表达相应升高。4.p53对MAGE-D4基因表达的影响:qRT-PCR结果显示:与U87MG-p53wt 组比较,U87MG-p53KO 组、U87MG-p53Mt248 和 U87MG-p53Mt175 组MAGE-D4 mRNA表达水平均明显升高,其中U87MG-p53Mt248和U87MG-p53Mt175 组对 MAGE-D4 mRNA 升高作用优于 U87MG-p53KO 组;与 A172-p53Wt组比较,A172-p53Mt248 和 A172-p53Mt175 组 MAGE-D4mRNA 表达明显升高,但A172-p53KO组无统计学差异。Western Blot结果显示:与U87MG-p53wt 组比较,U87MG-p53KO 组和 U87MG-p53Mt248 组 MAGE-D4 蛋白表达水平均升高,但U87MG-p53Mt175组MAGE-D4蛋白表达无明显变化,进一步比较发现U87MG-p53KO与U87MG-p53Mt248组MAGE-D4蛋白无统计学差异;A172-p53Mt248 和 A172-p53Mt175 组 MAGE-D4 蛋白水平明显高于 A172-p53wt 组和 A172-p53KO 组,但与 A172-p53W组比较,A172-p53KO组 MAGE-D4蛋白水平无明显改变。5.p53对MAGE-D4启动子活性的影响:含p53结合位点的MAGE-D4核心启动子报告基因活性测定结果显示:与U87MG-p53wt组比较,U87MG-p53KO 组、U87MG-p53Mt248 和 U87MG-p53Mt175 组 MAGE-D4 启动子的活性均显著升高,其中U87MG-p53Mt248和U87MG-p53Mt175组MAGE-D4启动子活性明显强于 U87MG-p53KO组。A172-p53KO 组、A172-p53Mt248 和 A172-p53Mt175组MAGE-D4启动子的活性均明显高于A172-p53wt组;但A172-p53Mt248 和 A172-p53Mt175 组与 A172-p53KO 组比较,仅 A172-p53Mt175 组 MAGE-D4 启动子活性明显升高,具有统计学意义。进一步缺失 p53 结合位点的MAGE-D4核心启动子报告基因活性测定结果显示:U87MG和A172中p53wt组和p53KO组的MAGE-D4核心启动子活性均无统计学差异。结论胶质瘤中野生型p53的缺失及第248和175位氨基酸点突变均可激活MAGE-D4启动子,促进MAGE-D4的表达。