背景:水貂是一种肉食性小型哺乳动物。水貂的皮毛轻柔结实,毛绒丰厚,可以制成多种毛皮制品,广受消费者欢迎。近年来,我国水貂产业发展迅速。然而,在水貂产业持续向好发展的同时,水貂的疫病,尤其是病毒性传染病给水貂养殖业带来了很大困扰。水貂的顽固性腹泻是一种由水貂圆环病毒（Mink circovirus,MiCV）感染引起的一种季节性传染病。该病发生在每年秋冬交替季节,主要引起水貂的红白痢,并伴有厌食、被毛粗乱等症状,发病率达到70-80%,多数病貂痊愈后毛皮质量下降,母貂次年繁殖能力降低;7-8%的病貂后期病情加重,出现黑色血便,口鼻苍白,最终死亡。自从上世纪70年代以来,该病一直在我国呈季节性暴发流行,严重威胁水貂养殖业的发展。然而,目前针对该病的防控技术非常有限,并且对该病的流行规律也缺乏系统全面的研究。目的:对我国主要水貂养殖区的MiCV感染情况进行流行病学调查,分析该病的流行规律,为该病的防控提供理论依据;建立MiCV重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）方法,为该病的防控提供一种先进的检测手段;利用杆状病毒表达系统表达MiCV的Cap蛋白,并以此为基础研制针对MiCV的亚单位疫苗,为该病的防控和清除提供技术支持。即本课题拟从流行病学规律研究、检测方法建立、疫苗研制三方面为水貂顽固性腹泻的防控提供全套的解决方案。方法:1.于2019年和2020年,前往辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城地区的水貂养殖场,对水貂顽固性腹泻发病情况进行现场调查并采集粪便样品进行检测,比较该病不同年份和不同地区的流行情况;比较不同性别、不同年龄水貂发病、死亡和感染情况,对发病水貂进行剖检,观察各组织脏器病变情况并取各组织脏器制作病理切片分析研究。检测发病水貂各组织脏器内的MiCV;通过对Cap基因进行序列比对分析2020年三地的MiCV Cap基因相比于2013年的突变情况。2.以英国Twist Dx公司的RPA试剂盒为基础,设计探针及若干对候选引物,从中筛选出扩增效果最佳的引物对,分别建立MiCV的基础RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。用不同浓度梯度的质粒作为模板进行RPA反应评估这两种方法的灵敏性;用PRA方法检测MiCV及其他几种水貂病毒,比较检测结果,评估RPA方法的特异性;对相同样品进行多次重复检测评估RPA方法的重复性;进一步优化反应条件,确定最佳反应温度、时间等参数;用这两种RPA方法检测46份临床样品,并与PCR方法检测结果进行对比。3.构建含有Cap基因的重组转移载体,将重组转移载体转化进含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞内。扩增培养后用碱裂解法抽提DNA获得重组杆粒,将重组杆粒转染Sf9细胞,构建重组杆状病毒。扩增培养重组杆状病毒,测定病毒滴度;比对第1、5、10、15、20代病毒Cap基因序列评估其传代稳定性;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blotting的方法鉴定Cap蛋白是否成功表达。将重组杆状病毒接种High Five细胞,并进行悬浮培养,摸索最佳接毒量及培养时间从而获得最大产量的Cap蛋白。利用Cap蛋白配合合适的佐剂制成亚单位疫苗,分别在辽宁庄河和山东诸城的两个水貂养殖场进行田间免疫试验,免疫组和对照组水貂分别经肌肉注射了一剂次的亚单位疫苗和对照制剂。大约9月末开始,即水貂顽固性腹泻疫情来临时持续观察两组水貂的粪便形态,并采集粪便样品检测MiCV,统计比较两组水貂的发病率和粪便样品阳性率,从而评估疫苗的效力。此外,还统计了两组水貂次年的平均每窝产仔数。结果:1.对辽宁庄河、河北昌黎和山东诸城地区水貂养殖场顽固性腹泻进行流行病学调查显示:2019年辽宁庄河地区MiCV感染率为42.0%,发病率为36.6%,病死率为6.1%;2020年辽宁庄河地区MiCV感染率为36.0%,发病率为30.3%,病死率为4.8%;河北昌黎地区MiCV感染率为31.0%,发病率为14.3%,病死率为3.3%;山东诸城地区感染率为26.0%,发病率为1.8%,病死率为0%。相比于2013年,MiCV感染率、发病率和病死率均有所下降;从地区来看,辽宁庄河地区的水貂群体MiCV流行情况最严重,河北昌黎地区次之,而山东诸城地区流行情况最轻微,红痢占比较低,即便有发病个体也鲜有死亡。从性别来看,雄性和雌性水貂对于MiCV的感染率、发病率和病死率没有区别。从年龄来看,多年貂相比于当年新貂,MiCV感染率和发病率都更低。剖检观察到了发病水貂脾脏、肾脏和肠的病变;病理切片研究表明:发病水貂的肝小叶中央静脉和门管区以及肾小球旁发生炎性细胞浸润;肠上皮内杯状细胞数量增加。对发病水貂不同脏器进行MiCV检测的结果显示,发病水貂大肠、肝、脾和肾等组织均存在MiCV病毒DNA。对2020年三地MiCV Cap基因测序分析并与2013年进行对比,结果表明辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城三地的MiCV Cap基因相比于2013年出现了多处碱基突变。其中MiCV-DL20 Cap基因产生14处碱基突变,导致4处氨基酸变化;MiCV-Hebei20 Cap基因碱基发生11处突变,导致3处氨基酸变化;MiCV-Shandong20 Cap基因发生3处碱基突变,但未引起氨基酸变化。2.成功建立了MiCV基础RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。基础RPA方法的灵敏度为5.4×102 copies/μL,而PCR方法的灵敏度为5.4×103copies/μL,基础RPA方法的灵敏性略高;用该方法对貂肠炎病毒、犬瘟热病毒及阿留申貂病病毒基因组进行扩增,未出现扩增条带,说明该方法具有良好的特异性;对不同浓度质粒标准品进行三次重复检测,灵敏度均能达到最大值,说明该方法的重复性良好;经过反应条件优化,确定了该方法的最佳反应条件为39℃、20min。该方法总检测耗时约为40 min,较PCR方法明显缩短。在此基础上,进一步建立了实时荧光RPA检测方法,其灵敏度达到了5.4×101copies/μL,灵敏度进一步提升。同样具有良好的特异性;批间重复试验和批内重复试验中,每次检测灵敏度都能够达到最大值,cq值变异系数在合理区间内,说明该方法重复性良好。经过反应条件优化,确定了该方法的最佳反应条件为39℃、20 min,醋酸镁浓度为140 m M。该方法相比基础RPA方法进一步缩短了检测时间,整个检测过程仅需20 min,并且配合便携式荧光扩增仪能实现现场快速检测。用这两种RPA方法和PCR方法检测同一批临床样品,两种RPA方法检测结果阳性率略高,但统计分析表明检测结果与PCR方法无显著差异。3.构建了重组转移载体、重组杆粒,并成功拯救出重组杆状病毒,培养滴度达到108TCID50/m L,传代稳定性良好,传代至第20代Cap基因也没有出现突变。间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blotting结果表明Cap蛋白得到了表达。随后将重组杆状病毒接种High Five细胞并实现了悬浮培养,经估算Cap蛋白产量最高达到了200μg/m L。以Cap蛋白为基础制备了MiCV亚单位疫苗。田间免疫试验结果显示:免疫组2000只水貂只有36只出现了典型腹泻症状,发病率为1.8%;而对照组1000只水貂有745只出现了典型腹泻症状,发病率为74.5%,免疫组的发病率明显低于对照组。对粪便样品进行检测显示,免疫组粪便样品MiCV阳性率为2.1%,而对照组为70.0%。整个田间试验过程中,未发现水貂接种疫苗后产生不良反应。此外,次年春天通过统计两组的怀孕母貂数和产仔总数得知,免疫组的平均每窝产仔数比对照组更高。结论:1.相比于2013年,水貂顽固性腹泻的感染率、发病率和病死率均有所下降;不同地区该病的流行情况有较大差异。不同性别水貂对于该病的易感性没有差异;而多年貂相比于当年新貂对于该病的易感性下降。发病水貂肝、脾、肾、肠上皮出现病变,多种组织脏器内存在MiCV病毒;辽宁庄河、河北昌黎、山东诸城三地2020年的MiCV毒株Cap基因序列相比于2013年发生了多处碱基突变,并引起了相应氨基酸的变化。2.成功建立了MiCV的基础RPA检测方法以及实时荧光RPA检测方法,检测灵敏度分别达到了5.4×102 copies/μL和5.4×101 copies/μL,且具备良好的特异性和重复性。这两种方法相比于PCR方法具有灵敏度高、反应速度快、常温下即可反应的优势。其中,实时荧光RPA方法能实现现场检测。3.成功构建了一株高效表达MiCV Cap蛋白的重组杆状病毒。利用表达的Cap蛋白制备了MiCV亚单位疫苗。田间试验表明该疫苗能显著减低水貂群体顽固性腹泻的发病率和感染率,且无明显不良反应,说明该疫苗具有良好的效力和安全性。此外还观察到免疫组水貂次年的平均每窝产仔数更高。本研究为MiCV的防控工作提供了理论依据和技术支持。