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急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种高度异质性血液恶性疾病,表现为原始或幼稚髓系细胞克隆性增生,正常造血受抑,外周血中白细胞出现质和量的异常、红细胞和血小板减少,并在体内各组织、器官(如肝、脾、淋巴结)出现广泛的白血病细胞浸润。目前,有许多新研制的化疗药物用于AML治疗,提高了疗效,延长了患者的生存期,但AML化疗耐药仍是临床治疗的难点,患者易复发难治愈。因此,找寻一种可以更好克服AML耐药问题的治疗方案迫在眉睫。白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)被认为是AML的起始细胞,具有自我更新、无限增殖、多向分化的潜能,对AML的发生发展、复发和耐药都有重要的作用。LSCs具有的低水平活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)可能是AML耐药的重要影响因素之一。氧化铁纳米颗粒(Iron Oxide Nanoparticles,IONPs)是近来新发现的纳米酶(nanozyme)家族的成员之一,在表面没有任何修饰的情况下,具有类似辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的活性,在酸性条件下催化过氧化氢反应生成羟基自由基(·OH),使得ROS水平升高。为找寻一种新的高效杀灭LSCs治疗方案,本研究通过流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)或免疫磁珠分选法(magnetic associated cell sorting,MACS),从人AML细胞系KG1a中得到CD34+CD38–的LSCs,采用IONPs(本研究使用Fe3O4)联合阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)处理LSCs及治疗AML模型小鼠,探究IONPs联合Ara-C对LSCs的体内体外作用效应及可能机制。目的:探究IONPs联合Ara-C对LSCs的体内外抑制效应及可能机制,为提高AML患者对化疗药物敏感性和生存率以及最终根治AML提供新思路和方法。方法与内容:1.LSCs分选与鉴定:根据细胞表面分子标记,采用FACS或MACS分选法,从人AML细胞系KG1a中分选出细胞表型为CD34+CD38–的LSCs及非CD34+CD38–的Non-LSCs,并通过增殖、耐药、软琼脂克隆等实验验证分选所得LSCs的干性。2.体外细胞实验:将分选后的LSCs和Non-LSCs,按对照组(Control)、Ara-C组(0.4μM)、IONPs组(150μg/ml)和Ara-C+IONPs组分别处理AML细胞系KG1a后,观察每组的细胞凋亡、ROS水平及相关基因、蛋白水平,分析其抗LSCs的效应及机制。3.体内治疗实验:用分选后的LSCs和Non-LSCs经尾静脉接种于NOD/SCID小鼠体内,每只小鼠接种细胞总数为5×105,以仅注射PBS组为正常对照组(Control),另按Ara-C组(50mg/kg/只/次)、IONPs组(10mg/kg/只/次)和Ara-C+IONPs组分别治疗,每3天一次,持续3周,观察并分析各组治疗效应及机制。治疗第20天后处死小鼠,取外周血、骨髓及脾脏等组织,进行相关检查、分析。结果:1.用流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)鉴定FACS分选所得细胞的纯度,结果显示,CD34+CD38–LSCs占KG1a细胞的比例约32%,分选后的纯度约94%。与Non-LSCs相比,CD34+CD38–LSCs在软琼脂培养基形成克隆数量更多,具有更强的耐药性,并能分化为CD34+CD38+细胞,即Non-LSCs。2.体外细胞实验结果显示,相比于Control、Ara-C、IONPs处理组,IONPs+Ara-C组处理的细胞,细胞内ROS水平显著性升高,凋亡更明显;细胞内促氧化基因gp91-phox、p40-phox、OGDH表达升高,抗氧化基因SOD1在m RNA和蛋白水平均下降,差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。联合处理组,LSCs高表达基因IFITM3下调,低表达基因CD38、DEPTOR上调,提示ROS升高可杀伤更多的LSCs,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。3.体内治疗实验结果显示,LSCs组NOD/SCID小鼠外周血白细胞数目增加、血红蛋白水平下降,与Non-LSCs对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。相比于Control、Ara-C、IONPs组,IONPs+Ara-C组小鼠血和骨髓涂片及血常规等上述指标,检测结果显示出缓解和减轻荷AML小鼠体征,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:1.人AML细胞系KG1a中CD34+CD38–细胞具有LSCs样特性,即LSCs。2.体外IONPs联合Ara-C能表现出比Ara-C更强地促进LSCs凋亡,此作用可能与IONPs促进细胞内ROS水平上升有关。3.体内小鼠动物实验结果显示,Ara-C+IONPs联合组对荷AML小鼠有更强的治疗效果,能更有效地杀灭LSCs,缓解和减轻白血病体征,提示Ara-C+IONPs合用是高效治疗AML的一种新方法。