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脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)属于神经营养因子家族成员,可通过其酪氨酸激酶受体信号系统参与神经元发生分化、突触可塑性和神经元存活等神经系统功能活动过程。BDNF在脑卒中后神经元损伤的保护和修复中发挥重要作用,然而,BDNF蛋白质表达的调控机制不明。酪氨酸激酶受体家族中最大的一类为Eph受体,ephrin配体-Eph受体信号系统在机体发育过程和体内稳态维持中发挥重要作用。Eph受体可分为EphA和EphB两个亚型,EphA受体主要参与神经系统发育过程中神经网络的形成、神经再生和突触可塑性。研究发现,短暂脑缺血大鼠海马CA1区锥体神经元的EphA4受体水平上调,拮抗EphA4受体功能可以减弱缺血后CA1区锥体神经元死亡。因此我们设想,Eph受体是否通过影响BDNF蛋白的表达,增强受损神经元的内在保护机制。本实验通过培养大鼠海马脑区原代神经元,观察拮抗EphA4受体功能后,神经元BDNF蛋白质及不同转录本表达的变化。前期研究发现,脑缺血再灌注后,大鼠海马CA1区BDNF蛋白质表达的降低与CA1区中BDNF转录本IV表达的降低相关。本研究通过建立大鼠短暂性脑缺血再灌注模型,给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA,研究BDNF在海马各区差异表达与组蛋白乙酰化的关系。这将为临床上脑卒中的治疗以及神经元保护提供新途径。第一部分EphA4受体对大鼠海马神经元BDNF蛋白质和转录本表达的影响目的:BDNF在脑卒中后神经元损伤的保护和修复中发挥重要作用,然而,BDNF蛋白表达的调控机制不明。通过培养大鼠海马脑区原代神经元,观察拮抗EphA4受体功能后,神经元BDNF蛋白及多种BDNF转录本表达的变化。方法:1.实验分组:采用1-3d的SD大鼠乳鼠,分离其海马组织,培养原代海马神经元。将培养的大鼠海马脑区神经元随机分为正常对照组(control组)和处理组(EphA4-Fc组),培养7d后用于实验。2.应用Western blot和RT-qPCR检测技术,给予EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能,分析检测培养神经元BDNF蛋白质及BDNF多种转录本表达的变化。结果:1.Western blot结果显示:与正常对照组相比,EphA4-Fc组大鼠海马脑区神经元BDNF蛋白质表达水平升高。2.RT-qPCR结果显示:与正常对照组相比,EphA4-Fc组大鼠海马脑区神经元BDNF转录本IIc表达升高,BDNF转录本I、III、IV、VI和X1的表达无显著变化。结论:给予EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能后,大鼠海马脑区神经元BDNF蛋白质翻译增加与BDNF转录本IIc表达升高相关。第二部分SAHA通过抑制组蛋白去乙酰化酶功能影响脑缺血大鼠海马BDNF转录本表达目的:脑缺血大鼠海马CA1区BDNF蛋白质表达的降低与CA1区中BDNF转录本表达改变相关。然而,BDNF转录本表达改变的机制尚不明确。通过建立大鼠短暂性前脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)模型,腹腔注射组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA,观察大鼠海马各区BDNF转录本表达的变化。方法:1.实验分组:假手术组(Sham组),短暂性前脑缺血再灌注组(I/R组),I/R+DMSO组(DMSO组)和I/R+SAHA组(SAHA组)。2.短暂性前脑缺血再灌注模型的制备:I/R组:SD雄性成年大鼠(240-260g),戊巴比妥钠(5mg/100g,i.p.)麻醉,经双耳固定于脑立体定位仪。经翼小孔电凝双侧椎动脉,同时分离双侧颈总动脉,术后24h,短暂夹闭双侧颈总动脉15min后恢复血液灌注,选取造模成功大鼠进行后续实验。DMSO组:在I/R前1h和I/R后24h,给予大鼠DMSO(50mg/kg,i.p.)处理。SAHA的溶剂是DMSO,DMSO组是溶剂对照组,为了排除溶剂对实验结果的影响。SAHA组:在I/R前1h和I/R后24h,给予大鼠SAHA(50mg/kg,i.p.)处理。Sham组:除椎动脉不电凝和颈总动脉不夹闭外,其余手术操作和I/R组一致。3.应用RT-qPCR技术检测不同实验组海马各区的BDNF不同转录本表达水平。结果:RT-qPCR结果显示:与I/R组或I/R+DMSO组相比,SAHA可以增加CA1区的BDNF转录本IV,VI和X1的表达,而转录本I,IIc和III无显著变化。同时,SAHA可以增加DG区的BDNF转录本X1的表达。SAHA对CA3区BDNF表达无显著变化。结论:SAHA通过调控蛋白质乙酰化水平,增加CA1区的BDNF转录本IV,VI和X1的表达。这将为脑卒中的防治提供新途径。