猕猴视觉皮层中GABA能相关基因表达量在衰老过程中的变化和平顶猴TRIM5α-Cyp融合基因HIV-1易感性分子机制的初步研究

来源 :中国科学院昆明动物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zlotu
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本文包括两方面独立的研究工作。第一部分是运用定量PCR的方法对猕猴视觉皮层中GABA相关的各种基因表达量的分析研究。通过比较不同年龄阶段的猕猴的表达差异,希望能从基因表达水平解释衰老过程中机体功能减退的遗传学机制,并从中寻找延缓或治疗相关的老年性变化的重要基因。第二部分主要是对平顶猴HIV-1易感性分子机制的初步研究,为建立合适的HIV-1动物模型提供实验基础。   随着社会人口老龄化,对脑老化及脑衰老的研究已成为人类面临的重大社会一医学问题。很多研究发现,随年龄的增长,脑内神经递质的代谢及其相关的受体发生变化都可能会导致脑功能的减退。因此,深入探讨随年龄增长的神经递质相关基因表达量的变化对了解生理性衰老过程的机制及对延缓衰老都十分有意义。GABA是神经系统中一种非常重要的抑制性神经递质,研究发现视觉皮层中GABA量的减少可能是视觉皮层功能衰退的生理基础。然而,目前有关灵长类GABA能系统随年龄的变化而改变的研究还比较少。因此,第一部分研究内容采用定量PCR的方法,对成年和中老年、老年猴初级视觉皮层(V1)中与GABA相关的25个基因表达水平比较分析,并对其中一个转运蛋白进行western blot蛋白水平年龄差异分析。主要得到以下结论:(1)大多数基因表达水平随年龄的增长而增加,可能是机体补偿机制的体现。(2)少数几个基因表达量降低:谷氨酸脱羧酶65(GAD65)和钾离子-氯离子共转运体KCC2。离子转运体KCC2的表达变化和蛋白western blot结果一致,可能其表达与细胞膜的去极化相关,表达量降低使突触后的抑制效应也减弱,引起机体功能的衰退。(3)成年猴的某些基因表达还存在性别差异。总之,本研究第一次对GABA相关基因表达量随年龄变化进行系统研究,通过不同年龄猕猴初级视觉皮层中基因表达比较,发现大多数基因的表达量随年龄的增加而变化。因此,GABA能系统基因表达水平随年龄增加而发生改变可能是导致视觉皮层功能正常衰退的分子机制。   大多数旧大陆猴不易被HIV-1感染,因为TRIM5α蛋白能限制HIV-1进入宿主细胞后的复制。但平顶猴是旧大陆猴中唯一例外,对HIV-1有易感性。第二部分内容主要对平顶猴易感HIV-1的分子机制进行初步研究。通过对平顶猴TRIM5α基因组测序和表达分析,发现平顶猴的TRIM5α3’UTR后插入CypA基因现象,巢式PCR和克隆找到一个有效的具有完整阅读框的剪切体(mnTRIMCyp),但这种融合方式不同与鹰猴中的融合形式(owlTRIMCyp)。我们发现将这一剪切体转入到表达载体pcDNA3.1转染细胞后,能正常表达蛋白(westernblot检测)。为了检测mnTRIMCyp融合蛋白是否对HIV-1的感染具有限制作用,还构建了平顶猴融合蛋白的表达载体去转染HeLa细胞,之后用HIV-1ⅢB和HIV-GFP-VSVG感染该HeLa细胞。实验结果发现mnTRIMCyp对不同浓度HIV-1的感染都无限制。所以,mnTRIMCyp融合蛋白对HIV-1复制无限制活性,这可能是平顶猴——旧大陆猴中唯一能被HIV-1感染的物种,易感HIV-1的分子机制。
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