论文部分内容阅读
球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus，简称Bs）和苏云金芽胞杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp．israelensis，简称Bti）是目前在世界范围内被成功应用于疾病媒介蚊虫生物防治的好氧芽胞杆菌。它们的杀蚊活性都依赖于在芽胞期产生的晶体蛋白，球形芽胞杆菌的晶体蛋白是由二元毒素（Binary toxins，Bin）组成，重复使用单一的二元毒素易致蚊幼虫产生抗性；而Bti的晶体蛋白则由多种毒素蛋白组成。广泛存在于自然界中的几丁质酶（Chitinase，EC 3.2.1.14）可水解昆虫中肠围食膜上的几丁质，使围食膜成型延迟或形成穿孔，有利于其他毒素更好的发挥作用而成为一种重要的生物防治因子。为探究几丁质酶在蚊虫防治中的具体作用，本论文对几丁质酶对蚊虫的毒力、几丁质酶基因的克隆和表达、几丁质酶同晶体毒素蛋白对蚊幼虫的协同毒杀作用进行了研究。首先测定了高产几丁质酶菌株粘质沙雷氏菌（Serretia marcescens）几丁质酶的杀蚊活性，证明几丁质酶对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）幼虫具有一定的毒力，但毒力较低，其LC50和LC90分别为8.99μg／ml和28.5μg／ml。同时，单独的几丁质酶对蚊幼虫还具有一定的后致死作用。当几丁质酶与二元毒素共同作用于敏感致倦库蚊幼虫时，几丁质酶表现出明显的对二元毒素的增效作用。采用特异性PCR和几丁质酶活性测定方法对本实验室保存的芽胞杆菌菌株的几丁质酶基因和酶活性进行了检测，表明所有球形芽胞杆菌标准血清型菌株均不含几丁质酶基因和不产生几丁质酶，26株蜡状芽胞杆菌（B．cereus）野生菌株有25株可产生几丁质酶活性，而苏云金芽胞杆菌的31个标准血清型菌株和31个野生型菌株中只有4个野生型菌株不含有几丁质酶基因和不产生几丁质酶。对筛选出的三株高几丁质酶活性的苏云金芽胞杆菌菌株T04A001、T13003及Gr-9的几丁质酶基因进行了克隆和序列测定，三个几丁质酶基因具有98％相似性，其编码的蛋白均由四个高度保守的主要功能域组成，即信号肽区、催化区、粘蛋白Ⅲ型类似区及几丁质结合区。在此基础上，完成了来源于T04A001菌株的几丁质酶基因chiAC ORF在T7启动子控制下的原核融合表达。重组菌株E-pETC21在1 mM IPTG诱导的条件下可大量表达产生几丁质酶，酶活最高可达到约420 U／ml。SDS-PAGE及Western blot分析显示，E-pETC21在产生70 kDa ChiAC表达带的同时，还可产生两条大小分别为40 kDa和29 kDa的降解带。将chiAC分别在自身营养期启动子和二元毒素芽胞特异性启动子调控下在杀蚊细菌野生菌Bti IPS78和Bs 2297中表达，得到的重组菌株分别在营养体时期和芽胞形成期能表达产生几丁质酶。几丁质酶在营养期的大量表达对重组菌株Bti-pBC的芽胞形成有一定的影响，随之也影响了重组菌株对蚊幼虫的毒力，但对重组菌株2297-pBC的芽胞形成及杀蚊毒力则没有显著影响。几丁质酶在芽胞形成期的表达对重组菌株Bti-pabC和2297-pBbC生长和芽胞形成没有影响。生物测定表明，在芽胞期表达几丁质酶的重组菌株对库蚊幼虫的毒力较野生菌株高。由于表达的外源几丁质酶对二元毒素的增效作用，重组菌株2297-pBbC对抗性蚊虫的毒力比野生菌株高约4，700倍。为今后为几丁质酶在蚊虫的生物防治中的应用奠定了基础。