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前言:宫颈癌(cervical cancer)是女性常见的妇科肿瘤，在世界范围内，宫颈癌的致死率位居女性恶性肿瘤第四位。虽然宫颈癌的筛查已经被广泛普及，但是仍有大部分患者确诊时位于中晚期，尤其是中国等发展中国家，而这些患者的五年生存率少于40％。值得一提的是超过三分之一的患者在经过一期治疗后，发生淋巴结转移或远处转移，正是出现转移最终导致了患者的死亡。然而导致宫颈癌发生发展的分子机制尚不清楚。 小分子RNA(miRNAs)是一类长约18-25核苷酸的非编码单链RNA分子，它是由约70nt的前体miRNA(即pre-miRNA)经Dicer酶剪切获得。miRNAs通过和靶基因mRNA的3-UTR区碱基位点特异性配对引起目标mRNA的降解或抑制其翻译，从而对靶基因的表达发挥转录后的调控作用。据统计，miRNAs调控至少1/3人类基因，表明miRNAs在肿瘤致癌过程中起到重要作用。很多研究表明miRNAs的表达失调频繁发生于人类恶性肿瘤发生发展过程中，影响着肿瘤细胞的增殖，凋亡和侵袭。一些报道表明miR-27b在肿瘤的发生发展中起到促癌或抑癌作用。尽管如此，miR-27b在宫颈癌的表达及作用机制尚不清楚。深入研究其作用机理将为肿瘤治疗提供新的策略，有望成为肿瘤早期诊断、判断预后的标志物和基因治疗的新靶点。 目的:本研究旨在探讨miR-27b在宫颈癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及与宫颈癌发生发展、转移及与临床病理学特征的关系，为临床治疗提供新的思路及依据。研究的第一部分，我们在宫颈癌细胞及组织中检测miR-27b的表达，通过生物信息学预测，检测到miR-27b调控的下游靶基因CDH11，检测CDH11在宫颈癌细胞及组织中的表达及二者的相关性，探讨miR-27b潜在的临床应用价值;研究的第二部分，在宫颈癌细胞系中上调/下调miR-27b的表达，通过细胞功能试验，观察其对宫颈癌细胞生物学特性行为的影响;检测分析其表达改变对靶基因CDH11的调控作用;第三部分通过Western Blot方法检测miR-27b和宫颈癌在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)之间的关系，探讨miR-27b使宫颈癌细胞发生增殖、侵袭的作用机制。 研究方法: 一、实验对象。2011年1月～2014年12月37例宫颈癌新鲜组织标本;同期正常宫颈组织标本37例;1株人表皮化永生细胞HaCaT，4株宫颈癌细胞HeLa，C33A，SiHa，CasKi。 二、实验方法。1、细胞培养:常规培养人宫颈癌细胞株和人永生化表皮细胞。2、茎环法逆转录聚合酶链式反应(stem-loop Polymerase Chain Reaction，stem-loop PCR)检测miR-27b在人宫颈癌组织、正常宫颈组织和人宫颈癌细胞系、永生化表皮细胞中的表达情况;实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitativereal-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)检测CDH11在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达情况。3、构建CDH11的3-UTR野生型及突变型质粒，与mimics NC和miR-27b mimics共转染C33A细胞，应用双荧光素酶报告基因实验(Luciferase)检测荧光素酶的变化。4、选取人宫颈癌细胞株HeLa、C33A，分别转染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR验证转染成功后分别应用RT-PCR和Western blot检测miR-27b的靶基因CDH11的表达情况。5、MTT法检测miR-27b对宫颈癌细胞增殖能力的影响。6、流式细胞周期实验检测miR-27b对细胞周期变化的影响。7、应用Transwell实验检测miR-27b对细胞侵袭能力的影响。8、应用划痕实验检测miR-27b对细胞迁移能力的影响。9、Westem blot检测miR-27b对EMT相关蛋白表达的影响。 结果:第一部分miR-27b及CDH11在宫颈癌中的表达情况及二者相关性。 1、stem-loop PCR结果显示，miR-27b在人宫颈癌组织中的表达水平要高于其在正常宫颈组织中的表达，同时在4株宫颈癌细胞中的表达水平亦高于正常人表皮细胞。37例宫颈癌组织中miR-27b的表达量为0.244，正常宫颈组织中表达量0.199，两组间差异具有统计学意义(p＜0.05)。2、37例宫颈癌组织CDH11的表达量为1.907，正常宫颈组织中CDH11的表达量为2.631，差异有统计学意义(p＜0.05)。3、Pearson相关系数分析miR-27b及CDH11在宫颈癌组织表达相关性，r=-0.506，呈负相关，p＜0.05。第二部分miR-27b对宫颈癌细胞生物学特性的影响及其对靶基因CDH11的调控。1、生物信息学预测结果提示miR-27b与靶基因CDH11 mRNA的3UTR区域169-176位点可形成互补配对结合，且该序列在多种属间高度保守。Luciferase结果验证了以上miR-27b与CDH11的结合位点成立:与共转染突变型CDH11-3UTR报告基因载体相比，共转染miR-27b和野生型CDH11-3UTR报告基因载体时，荧光素酶活性降低(P＜0.05)。2、选取人宫颈癌细胞株HeLa、C33A，分别转染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR验证转染成功后分别应用RT-PCR和Western blot检测miR-27b的靶基因CDH11的表达情况。上调miR-27b表达后CDH11在mRNA和蛋白水平的表达均出现显著下调;下调miR-27b表达，CDH11在mRNA和蛋白水平表达均出现显著上调，差异均有统计学意义。3、在HeLa细胞下调miR-27b的表达，MTT实验结果显示细胞增殖能力下降;细胞周期实验结果显示细胞周期阻滞于G1/S期;Transwell实验结果显示，细胞侵袭能力下降;MTT划痕法检测到细胞的迁移能力下降明显。在C33A细胞中上调miR-27b的表达，实验结果相反。4、证实miR-27b通过调控靶基因CDH11从而诱导宫颈癌细胞的增殖和侵袭。在HeLa细胞共转染inhibitor NC+siRNA NC、miR-27b inhibitor+siCDH11 NC或共转染miR-27binhibitor+siCDH11;在C33A细胞共转染mimics NC+vector、 miR-27bmimics+vector或共转染miR-27b mimics+CDH11，通过western blot证实上调或下调CDH11能够逆转miR-27b对CDH11表达的影响。5、MMT实验结果显示敲除CDH11能够显著逆转miR-27b inhibitor对HeLa细胞增殖的抑制作用;而过表达CDH11能够显著抑制miR-27b诱导的C33A细胞的增殖。6、流式细胞周期结果为上调CDH11能抑制miR-27b诱导的C33A细胞从G1到S期转化;而敲除CDH11能解除miR-27b inhibitor对HeLa细胞从G1期到S期转化的阻滞。7、划痕实验和侵袭实验结果显示上调CDH11表达，能够逆转miR-27b诱导引起的C33A细胞的迁移和侵袭能力的增高;而敲除CDH11的表达，能够解除miR-27b inhibitor对HeLa细胞的迁移和侵袭的抑制作用。第三部分miR-27b促使宫颈癌细胞发生EMT。1、Western blot检测miR-27b对上皮-间质转化蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)表达的影响。应用miR-27b mimics上调其表达，E-cadherine表达下降，vimentin、N-cadherin表达升高。应用miR-27b inhibitor下调其表达，E-caderine表达升高，vimentin、N-cadherin表达下降。3、敲除miR-27b/同时敲除miR-27b和CDH11、过表达miR-27b/同时过表达miR-27b和CDH11之后，western blot检测上皮-间质转化蛋白表达变化。结果显示:同阴性对照组相比，敲除miR-27b后E-cadherine表达升高，vimentin、N-cadherin表达降低;而敲除miR-27b的同时再敲除CDH11，敲除miR-27b对EMT蛋白的上述作用消失，表现为与阴性对照组相同的结果，即E-cadherine表达下降，vimentin、N-cadherin表达升高。同样，过表达miR-27b后，E-cadherine表达下降，vimentin、N-cadherin表达升高;而过表达miR-27b的同时再过表达CDH11，则miR-27b的表达升高所带来的EMT蛋白表达量的改变被逆转，表现为与阴性对照组相同的结果，即E-cadherine表达升高，vimentin、N-cadherin表达降低。 结论:1、与人正常上皮细胞及宫颈组织相比，miR-27b在宫颈癌细胞及组织中呈高表达，且在宫颈癌组织中miR-27b与CDH11的表达呈负相关。2、通过Luciferase结果证实CDH11是miR-27b的直接作用靶基因。3、miR-27b能促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。4、miR-27b是通过调控靶基因CDH11从而影响宫颈癌细胞的生物学行为。5、miR-27b促使宫颈癌细胞发生EMT，从而促进宫颈癌的发生发展。