BM MSCs免疫抑制及HO-1/MSCs对大鼠受损肠道修复作用的研究

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:LIUCHANGQI2003
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目的:1、探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)对淋巴细胞增殖的作用。   2、探讨BMMSCs及转染HO-1后的BMMSCs(HO-1/MSCs)移植对肠道缺血再灌注损伤(ischemiaandreperfusioninjury,IRI)的保护作用。   方法:1、体外实验:分离和鉴定大鼠BMMSCs,与淋巴细胞、刀豆蛋白(Concanavalin,ConA)建立共培养体系,混合培养0h、24h和48h后,用ELISA方法检测上清中TNF-α、TGF-β1和IL-10的分泌量,MTT方法检测淋巴细胞数目变化,流式细胞仪检测调节T细胞(RegulatoryTcells,Treg)的含量变化。   2、体内实验:(1)取同龄健康雄性Wistar大鼠骨髓,进行体外提取、培养BMMSCs,将采用密度梯度离心法传代培养的第3代细胞进行表型鉴定并制备悬液备用。(2)在健康Wistar大鼠肠黏膜下注射皮肤黑色素瘤细胞,并用底物荧光素法示踪细胞。(3)建立同龄健康雄性Wistar大鼠的肠道缺血-再灌注模型,分为实验组(1mlHO-1/MSCs或1mlBMMSCs经肠黏膜下植入)和对照组(等量生理盐水经肠黏膜下注射)。(4)标本制备:于术后不同时间(0、2、6、24、72、120h)留取血清,采用酶联免疫法(ELISA)、光镜、透射电镜、蛋白印迹杂交(Westernblot)、免疫组织化学等方法进行检测。   结果:1、体外实验:BMMSCs可使TNF-α分泌量降低,TGF-β1和IL-10分泌量升高,细胞增殖实验显示OD值明显低于未加BMMSCs组的对照组(P<0.05),流式细胞仪检测显示BMMSCs可使Treg含量升高。   2、体内实验:(1)体外成功分离、扩增、纯化BMMSCs,原代细胞消化传代后杂质细胞减少,细胞纯度提高。培养的第三代贴壁细胞大部分表达CD29、CD90及RT1A,表达率分别达97.12%、97.07%及98.07%,而不表达CD34、CD45及RT1B。(2)注射B16-F10-Luc-G5细胞2h后,细胞定植在肠道,获取大鼠肠道,大量PBS反复冲洗,仍然可见细胞明显定植,并可以长期存活。(3)夹闭肠系膜前动脉后,动脉搏动消失,肠管变白、痉挛、皱缩、蠕动丧失,恢复动脉搏动后,肠管颜色逐渐变红。(4)形态学方面:实验组小肠组织HE染色显示:小肠绒毛水肿、肠上皮细胞坏死、肠道间质充血及炎症细胞浸润程度与对照组相比明显减轻,并且HO-1/MSCs组较BMMSCs组效果更为显著;电镜下显示:实验组小肠绒毛破坏程度减轻,肠道紧密连接完整,细胞器恢复正常形态,HO-1/MSCs组效果更为显著。(5)血清ELISA结果:实验组血清中二胺氧化酶(Diamineoxidase,DAO)、D-乳酸和TNF-α含量均较对照组减少,以HO-1/MSCs更为明显,差异具有统计学意义。(6)免疫组化及Westernblot结果均显示Occludin蛋白的表达在实验组明显高于对照组,尤其是HO-1/MSCs组,这提示单纯BMMSCs组能够促进Occludin蛋白的生成,并且HO-1/MSCs组能够发挥HO-1与BMMSCs的协同作用,对Occludin蛋白的表达共同起到促进作用。   结论:1、体外实验:(1)用密度梯度离心联合贴壁法可分离、纯化大鼠BMMSCs,方法简单,费用低廉,易应用;且BMMSCs在体外可以大量扩增,传代培养的细胞纯度较高,为后续实验提供了充足的细胞来源。(2)BMMSCs在单独存在时对淋巴细胞的增殖具有抑制作用,并且作用程度随时间变化不明显,其中IL-10、TGF-β1以及Treg细胞参与了这种免疫抑制过程。   2、体内实验:(1)夹闭大鼠肠系膜前动脉可以造成大鼠肠道黏膜的溃疡、出血和坏死,模型稳定,适合作为研究对象。(2)在缺血再灌注损伤的大鼠肠黏膜下移植HO-1/MSCs或BMMSCs可以修复受损肠道功能、小肠黏膜上皮结构、小肠上皮细胞间紧密连接和提高紧密连接蛋白(Occludin)的表达水平,从而阻止肠道缺血再灌注损伤导致的小肠通透性的升高,且HO-1/MSCs效果更好,证实了HO-1能够延长BMMSCs保护大鼠小肠所受到的缺血再灌注损伤。
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