研究背景急性脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是指脊髓遭受到外力打击后导致完全性或不完全性脊髓运动、感觉、括约肌等功能障碍,是脊柱外科领域一种常见的且破坏性极大的疾病。至今仍缺乏有效的治疗措施,探索有效的治疗药物一直是急性脊髓损伤研究的热点。研究表明,局部微循环障碍是急性脊髓损伤后脊髓继发性损伤加剧的重要原因,改善微循环对于促进脊髓创伤后修复具有重要意义。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)是一种从中药川芎中提取的生物活性单体,具有积极的抗缺血作用。本课题组长期研究川芎嗪对急性脊髓损伤的保护作用,并通过大鼠急性脊髓挫伤模型发现其有改善微循环、促进神经功能恢复等作用。本实验同样以大鼠急性脊髓挫伤模型为基础,观察川芎嗪对微血管的主要组分血管内皮细胞、Ⅳ型胶原和层连蛋白及对血管再生具有调节作用的Ⅰ型胶原和ⅩⅧ型胶原和对Ⅳ型胶原有裂解作用的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs) MMP-2和MMP-9的表达影响,以期进一步了解川芎嗪对急性脊髓损伤后的微血管保护机制。第一章川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后血管内皮细胞凋亡和微血管密度的影响目的观察川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后血管内皮细胞凋亡和微血管密度的影响。方法SD雄性大鼠共130只,其中10只大鼠只行椎板减压术,不予脊髓打击作为正常对照组(Sham组),其余60只大鼠以改良Allen’s打击法制作不完全性急性脊髓挫伤模型,随机分为川芎嗪治疗TMP组(n=30)和生理盐水治疗NS组(n=30)。TMP组大鼠于术后30分钟至术后5天予以盐酸川芎嗪腹腔注射治疗(200mg/kg, Qdx5天)(1、3天组分别给药至处死前)；NS组大鼠予以等量生理盐水作相同干预,给药时间、剂量和频次同TMP组。每组(n=60)脊髓损伤大鼠分别用于免疫荧光检测血管内皮细胞凋亡、HE染色和免疫组化检测微血管密度。用于检测的大鼠分别于术后1、3、7、14、21和28天共6个时间点被处死,每个时间点每组处死大鼠分别为n=10只,收取损伤段脊髓标本。应用SPSS17.0软件进行统计分析,对于计数资料的同一时间点的组间比较采用Mann-Whitney U检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)HE染色示损伤后脊髓内先后存在广泛出血、血肿形成、血肿吸收、胶原细胞增生、瘢痕形成等病理进程。(2)TMP组和NS组均在损伤后1天即出现凋亡的血管内皮细胞,但NS组在3天时凋亡血管内皮细胞个数至峰值,14天之后凋亡细胞消失；TMP组在1天时凋亡血管内皮细胞个数最多,随后即下降,7天之后即消失。在3天、7天、14天三个时间点血管内皮细胞凋亡百分比TMP组均显著明显少于NS组(P<0.05)。(3)TMP组和NS组均在损伤后1天时微血管密度明显减少,随后逐渐增高,至14天之后均继续无明显增长,但损伤后个时间点的血管内皮细胞较Sham组排列均显紊乱。在3天、7天、14天TMP组微血管密度均显著大于NS组(P<0.05)。结论(1)川芎嗪可抑制急性脊髓损伤后的血管内皮细胞凋亡。(2)川芎嗪可显著提高急性脊髓损伤后的微血管密度。第二章川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后胶原成分和层连蛋白的影响目的观察川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后Ⅳ型胶原、层连蛋白、Ⅰ型胶原和ⅩⅧ型胶原表达影响。方法SD雄性大鼠共65只,其中5只大鼠只行椎板减压术,不予脊髓打击作为正常对照组(Sham组),其余60只大鼠以改良Allen’s打击法制作不完全性急性脊髓挫伤模型,随机分为川芎嗪治疗TMP组(n=30)和生理盐水治疗NS组(n=30)。TMP组大鼠于术后30分钟至术后5天予以川芎嗪腹腔注射治疗(200mg/kg, Qdx5天)(1、3天组分别给药至处死前)；NS组大鼠予以等量生理盐水作相同干预,给药时间、剂量和频次同TMP组。脊髓损伤大鼠用于免疫组化检测Ⅳ型胶原、层连蛋白、Ⅰ型胶原和ⅩⅧ型胶原。大鼠分别于术后1、3、7、14、21和28天共6个时间点被处死,每个时间点每组处死大鼠分别为n=5只,收取损伤段脊髓标本。应用SPSS17.0软件进行统计分析,对于计数资料的同一时间点的组间比较采用Mann-Whitney U检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)TMP组和NS组均在损伤后1天即出现Ⅳ型胶原阳性表达增多,其表达来源除了血管内皮细胞外,还有神经元、单核细胞、胶质细胞等,在基质中也有弥散分布。损伤1天后,两组阳性表达细胞数目逐渐上升,均在7天时达到峰值随后逐渐下降。TMP组在1天、3天、7天、14天的Ⅳ型胶原阳性细胞数目显著大于NS组(P<0.05)。(2)TMP组和NS组均在损伤后1天即出现层连蛋白阳性表达增多,其表达来源除了原血管内皮细胞外,在神经元、胶质细胞等表达,其中神经元胞质表达最为明显。损伤1天之后,两组阳性表达细胞数目逐渐上升,均在7天时达到峰值随后逐渐下降。TMP组在3天和7天层连蛋白阳性表达细胞数目显著大于NS组(P<0.05)。(3)TMP组和NS组均在损伤后1天即出现Ⅰ型胶原阳性表达,阳性细胞数目在损伤后7天时达到峰值随后逐渐下降。表达部位主要为神经元和单核细胞。在3天、7天、14天三个时间点TMP组阳性细胞个数均显著大于NS组(P<0.05)。(4)NS组在损伤后7天开始出现ⅩⅧ型胶原阳性表达,最初表达部位为单核细胞和血管内皮细胞,随后神经元逐渐出现表达,阳性细胞数目逐渐增多至21天达到峰值,随后下降；而TMP组在14天时才出现ⅩⅧI型胶原阳性表达,表达部位同NS组,阳性细胞数目逐渐升高至28天到峰值。在7天、14天、21天三个时间点TMP组阳性细胞数均显著小于NS组(P<0.05)。结论(1)川芎嗪可促进脊髓损伤后早期的Ⅳ型胶原、层连蛋白和Ⅰ型胶原的表达。(2)川芎嗪可降低脊髓损伤ⅩⅧ型胶原的表达。第三章川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后MMP-2和MMP-9表达的影响目的观察川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后MMP-2和MMP-9表达的影响。方法SD雄性大鼠共130只,其中10只大鼠只行椎板减压术,不予脊髓打击作为正常对照组(Sham组),其余120只大鼠以改良Allen’s打击法制作不完全性急性脊髓挫伤模型,随机分为川芎嗪治疗TMP组(n=60)和生理盐水治疗NS组(n=60)。 TMP组大鼠于术后30分钟至术后5天予以盐酸川芎嗪腹腔注射治疗(200mg/kg, Qdx5天)(1、3天组分别给药至处死前)；NS组大鼠予以等量生理盐水作相同干预,给药时间、剂量和频次同TMP组。每组(n=60) SCI大鼠分别用于免疫组化检测MMP-2、MMP-9表达分布(IHC,n=30)和蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测MMP-2、MMP-9蛋白表达水平(IF,n=30)。用于不同检测目的大鼠分别于术后1、3、7、14、21和28天共6个时间点被处死,每个时间点处死大鼠分别为n=20只,收取损伤段脊髓标本。利用SPSS17.0统计学软件包对所有数据进行统计学分析。对计量资料的同一时间点的组间的均数比较采用t检验,对于计数资料的同一时间点的组间比较采用Mann-Whitney U检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果(1)免疫组化发现,TMP组和NS组均在损伤后1天即有MMP-2阳性表达并逐渐上升,表达部位在神经元、胶质细胞和单核细胞。两组阳性细胞个数在3天时均达到峰值随后逐渐下降。TMP组阳性细胞个数在1天、3天、7天和14天显著小于NS组(P<0.05)。(2)运用Western blot法检测脊髓组织中MMP-2蛋白的表达发现,损伤发生1天后MMP-2即有明显表达增加,并逐渐上升,在3天时到达峰值随后下降。在1天、3天、7天和14天TMP组表达明显小于NS组,有统计学差异(P<0.05)。(3)免疫组化发现,TMP组和NS组均在损伤后1天即有MMP-9阳性表达,表达部位也在神经元、胶质细胞、单核细胞。两组阳性细胞个数均在1天时最多,随后即下降。TMP组在1天、3天、7天、14天和21天阳性细胞数显著小于NS组(P<0.05)。(4)运用Western blot法检测脊髓组织中MMP-9蛋白的表达发现,损伤发生1天后MMP-9即有明显表达增加,随后逐渐下降。在1天、3天、7天、14天和21天TMP组表达明显小于NS组,有统计学差异(P<0.05)。结论川芎嗪可以减少脊髓损伤后的MMP-2和MMP-9的表达。