【摘 要】
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第一部分hiPSC-CMs生物学特性检测目的检测hiPSCs诱导成为hiPSC-CMs前后细胞形态和标志物的变化以及线粒体形态的改变。方法hiPSCs通过专用培养基维持细胞干性,进行细胞扩增;当hiPSCs长至一定密度,通过在第0天添加含GSK3抑制剂（CHIR99021）培养基、第2天换无胰岛素B27培养基、第3天添加含Wnt通路抑制剂（IWP2）培养基、第5天换无胰岛素B27培养基、第7天换含
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第一部分hiPSC-CMs生物学特性检测目的检测hiPSCs诱导成为hiPSC-CMs前后细胞形态和标志物的变化以及线粒体形态的改变。方法hiPSCs通过专用培养基维持细胞干性,进行细胞扩增;当hiPSCs长至一定密度,通过在第0天添加含GSK3抑制剂（CHIR99021）培养基、第2天换无胰岛素B27培养基、第3天添加含Wnt通路抑制剂（IWP2）培养基、第5天换无胰岛素B27培养基、第7天换含胰岛素B27培养基、第14天含乳酸钠培养基进行纯化、第17天进行重接种,来进行hiPSC-CMs诱导。并通过免疫荧光对hiPSCs干性因子和hiPSC-CMs心肌相关标志物进行检测;RT-q PCR检测hiPSC-CMs肌钙蛋白TNNI1、TNNI3和肌球蛋白重链MYH6、MYH7的表达;Mito Traker检测hiPSCs和hiPSC-CMs细胞内线粒体形状和分布情况;JC-1检测hiPSCs和hiPSC-CMs线粒体膜电位;电镜检测hiPSCs和hiPSC-CMs细胞线粒体形态。观察hiPSCs和hiPSC-CMs细胞形态和不同标志物的表达,以及线粒体形态结构和膜电位的变化。结果hiPSCs胞体小而呈圆形,细胞核位于中央,细胞间紧密排列形成细胞团块,细胞团边缘光滑,细胞表达干性因子Nanog和SOX2;hiPSC-CMs在第7天开始跳动,重接种后可观察到单个细胞搏动,免疫荧光和RT-q PCR结果显示hiPSC-CMs表达心肌相关标志物c Tn T、Cx43、α-actinin以及肌钙蛋白TNNI1、TNNI3,肌球蛋白重链MYH6、MYH7;Mito Traker结果显示hiPSCs线粒体呈散在点状分布于胞质中,hiPSC-CMs线粒体由点状变为线状或网络状环绕于核周;JC-1结果显示hiPSCs经诱导后线粒体膜电位红色荧光增强;电镜结果显示hiPSCs线粒体体积较小,嵴疏松,hiPSC-CMs细胞中线粒体体积增大长度变长且嵴变丰富。结论hiPSCs具有多能性可进行诱导;经诱导后形成的hiPSC-CMs表现出心肌细胞样特征;诱导过后细胞形态、线粒体结构均发生了很大转变。第二部分齐墩果酸介导丙酮酸激酶同工型转换促进hiPSC-CMs成熟目的探究齐墩果酸在hiPSC-CMs成熟过程中的作用。方法CCK8检测hiPSC-CMs加入齐墩果酸（OA）后的细胞活性,WB检测丙酮酸激酶M1型（PKM1）与丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表达以确定药物浓度用于后续实验;将hiPSC-CMs分为三组:Control组、DMSO组和OA加药组,用最适药物浓度和同等DMSO处理细胞用于后续实验;对三组细胞α-actinin免疫荧光染色进行细胞大小、形态和肌节长度分析;WB对三组细胞PKM1、PKM2、MFN2的表达进行检测;RT-q PCR对心肌相关基因TNNI3、MYH6、MYH7进行检测;Mito Traker对细胞线粒体形态结构进行观察;JC-1对细胞线粒体膜电位进行观察;电镜对三组细胞线粒体超微结构进行观察;EDU检测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果细胞活性检测和WB检测PKM1和PKM2蛋白表达确定10umol/L为OA的最适药物浓度;免疫荧光结果显示,加入OA后hiPSC-CMs细胞面积增大、细胞圆度指数降低、肌节长度增加;WB结果显示,OA加药组PKM1/PKM2比值和MFN2表达增加;RT-q PCR结果显示OA加药组心肌相关基因TNNI3、MYH6、MYH7表达增加;Mito Traker结果显示,对照组线粒体多为线状散在分布,OA加药组线粒体形成更为成熟的的网状结构;JC-1结果显示OA加药组线粒体膜电位有所增强;电镜下可观察到与对照组相比,OA加药组线粒体更为细长且有线粒体融合趋势;EDU结果显示OA加药组细胞增殖降低;细胞周期结果显示OA加药组多核细胞占比上升,而单核细胞的比例下降。结论加入OA后,hiPSC-CMs细胞形态和肌节结构向更成熟发展,心肌相关蛋白和基因表达也说明加药后细胞更加成熟。而线粒体形态结构的变化也说明OA可促进hiPSC-CMs线粒体向更成熟方向发展;EDU结果显示OA加药组细胞增殖下降,但细胞周期结果显示OA加药组细胞多核数目细胞增多,说明OA加药组细胞多核化增多。这些结果均表明加入OA后促进了hiPSC-CMs的成熟。
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