卵巢功能下降是妇科内分泌领域及生殖领域的常见问题,进一步发展可导致卵巢功能的衰竭。由于导致卵巢功能下降的病因复杂,现代研究尚未明确其发病机制,西医对改善卵巢功能尚缺乏明确有效的治疗措施。近年来,中医药被广泛应用于提高卵巢功能的临床治疗和实验研究,并取得了一定的研究进展,但同时也面临着许多问题,如缺乏中药复方制剂,未明确中药对该病的作用机理等。本项目研究中的“养阴舒肝颗粒”是由王小云教授经过30多年的临床实践总结而来,临床用于提高卵巢功能的治疗,在长期的临床使用中疗效明确,且未有不良反应、毒副作用的报道。基于养阴舒肝颗粒良好的临床疗效,本研究将进一步从药理学角度探讨该药的疗效、作用机制及安全性评价,为养阴舒肝颗粒改善卵巢功能提供实验依据,同时为新药的研发提供科学基础。目的:1.研究养阴舒肝颗粒对去氧乙烯基环己烯（4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD）诱导卵巢功能下降大鼠卵巢功能的影响及可能的作用机制。2.研究不同剂量的养阴舒肝颗粒对SD大鼠的影响,初步评价其安全性。方法:1.养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠的药效及机制研究选取动情周期规则的70只8周龄雌性SD大鼠,取10只大鼠作为空白组,除空白组外,其余SD雌性大鼠每天1次腹腔注射160mg/kg VCD,连续注射15d,建立卵巢功能下降大鼠模型。空白组腹腔注射生理盐水,连续注射15 d。取造模成功大鼠56只按体重随机分为5组,模型组、养阴舒肝低、中、高剂量组、坤泰胶囊组,每组11只（模型组12只）。各给药组大鼠均按剂量每天1次灌胃10 ml/kg,空白组、模型组大鼠给予等体积蒸馏水,连续4周。观察大鼠的一般情况、体重变化,记录大鼠的动情周期,将大鼠麻醉取材后,进行卵巢称重和计算卵巢指数,观察卵巢组织形态学的变化,对各级卵泡数目进行计数,采用酶联免疫法检测血清性激素（FSH、E₂、AMH）水平和氧化相关物质（SOD、GSH-PX、MDA）的含量,采用免疫组化法检测卵巢组织PI3K、Akt、FoxO3a蛋白的表达水平,采用蛋白免疫印迹法检测卵巢组织FoxO3a蛋白及凋亡因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白）的表达水平。所得数据采用SPSS 22.0进行统计学分析。2.养阴舒肝颗粒的安全性评价实验选取5⁶周龄的160只雌性SD大鼠,适应性喂养1周后随机分为:空白组、养阴舒肝低剂量组、养阴舒肝中剂量组和养阴舒肝高剂量组,按15 mL/kg分别经口灌胃蒸馏水、0.26g浸膏/mL、0.51g浸膏/mL及1.02g浸膏/mL,每天1次,连续灌胃13周。观察养阴舒肝颗粒对大鼠一般情况、血液学、肝肾功能的影响。所得数据采用SPSS 22.0进行统计学分析。结果:1.养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠的药效及机制研究（1）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠一般情况及动情周期的影响（1）大鼠的一般情况:与空白组比较,模型组皮毛疏散,活动减弱,饮食减少,腹胀明显,出现腹泻。与模型组比较,养阴舒肝颗粒各剂量组大鼠的一般情况均逐渐好转,腹胀、腹泻也可见明显好转;坤泰胶囊组大鼠的活动、饮食等一般情况逐渐好转,但腹胀、腹泻未见明显好转。（2）大鼠的体重:给药4周后与给药2周比较,各药物组大鼠的体重均呈增长趋势。给药4周后,与空白组比较,模型组大鼠的体重下降,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,养阴舒肝低、中剂量组大鼠的体重均呈增长趋势,但差异无统计学意义（P≥0.05）。养阴舒肝各剂量组与坤泰胶囊组比较,差异均无统计学意义（P≥0.05）。养阴舒肝中剂量组与低剂量组、高剂量组疗效相当,差异均无统计学意义（P≥0.05）。（3）大鼠的动情周期:与空白组比较,模型组大鼠的动情周期出现延长,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,养阴舒肝中、高剂量组和坤泰胶囊组大鼠动情周期出现延长的数目明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与对照药物组比较,养阴舒肝中、高剂量组与坤泰胶囊组疗效相当,差异均无统计学意义（P≥0.05）。养阴舒肝中剂量组优于低剂量组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠卵巢重量和卵巢指数的影响（1）卵巢重量:与空白组比较,模型组大鼠的双侧卵巢重量均明显降低,差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,养阴舒肝低、高剂量组大鼠的双侧卵巢重量和中剂量组的左侧卵巢重量均明显增加,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝高剂量组优于坤泰胶囊组,差异均有统计学意义（P<0.05）。养阴舒肝中剂量组与养阴舒肝低、高剂量组疗效相当,差异均无统计学意义（P≥0.05）。（2）卵巢指数:与空白组比较,模型组大鼠的卵巢指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,养阴舒肝各剂量组和坤泰胶囊组的卵巢指数均增加,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝高剂量组优于坤泰胶囊组,差异有统计学意义（P<0.01）。养阴舒肝中剂量组与养阴舒肝低、高剂量组疗效相当,差异均无统计学意义（P≥0.05）。（3）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠的卵巢组织形态学观察、卵泡计数的影响（1）卵巢组织形态学观察:与空白组比较,模型组卵巢结构紊乱,皮质出现增生伴纤维化,颗粒细胞排列疏松,各级发育及成熟卵泡数目减少,其中以始基卵泡、初级卵泡的数目明显减少,结构破坏,闭锁卵泡数目明显增多,伴有炎性浸润,髓质部分发生萎缩。与模型组比较,各给药组大鼠的卵巢皮质增生较少,可见正常形态的卵泡,始基卵泡、初级卵泡数目增多,闭锁卵泡数目减少,髓质无明显萎缩。（2）各级卵泡计数:与空白组比较,模型组大鼠的始基卵泡、初级卵泡数目明显下降,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;次级卵泡、成熟卵泡数目增加,但差异均无统计学意义（P≥0.05）;闭锁卵泡数目明显增多,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,各给药组有提高各级发育和成熟卵泡数目的趋势,但差异均无统计学意义（P≥0.05）。在降低闭锁卵泡的数目方面,与模型组比较,养阴舒肝低、中剂量组的闭锁卵泡数目均减少,差异均有统计学意义（P<0.05）;与对照药物组比较,养阴舒肝低剂量组的疗效优于坤泰胶囊组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠血清性激素水平的影响与空白组比较,模型组血清FSH水平升高、E₂和AMH水平降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较,各给药组血清FSH水平均呈下降趋势,血清E₂和AMH水平均呈升高趋势,其中养阴舒肝高剂量组和坤泰胶囊组的差异均有统计学意义（P<0.05）,养阴舒肝高剂量组与坤泰胶囊组比较,差异无统计学意义（P≥0.05）。（5）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠氧化相关物质的影响与空白组比较,模型组血清GSH-PX和SOD活力均降低、MDA水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较,各给药组血清GSH-PX和SOD活力均呈升高趋势、MDA水平呈下降趋势,其中养阴舒肝高剂量组和坤泰胶囊组的差异均有统计学意义（P<0.05）。养阴舒肝高剂量组与坤泰胶囊组比较,差异无统计学意义（P≥0.05）。（6）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠卵巢组织PI3K/AKT/FoxO3a通路相关蛋白的影响（1）卵巢组织PI3K蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组PI3K蛋白表达水平显著下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,养阴舒肝中、高剂量组及坤泰胶囊组PI3K蛋白表达水平明显上调,差异具有显著性统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝中、高剂量组与坤泰胶囊组疗效相当,差异均无统计学意义（P≥0.05）。养阴舒肝中剂量组与养阴舒肝其他（低、高）剂量组比较,差异均无统计学意义（P≥0.05）（2）卵巢组织Akt蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组Akt蛋白表达水平显著下调,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,各给药组Akt蛋白表达水平均明显上调,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,坤泰胶囊组优于养阴舒肝低剂量组,差异有统计学意义（P<0.01）。养阴舒肝各剂量组呈量效递增关系,养阴舒肝高剂量组优于中剂量组,养阴舒肝中剂量组优于低剂量组,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。（3）卵巢组织FoxO3a蛋白的表达水平:采用免疫组化法检测,与空白组比较,模型组FoxO3a蛋白表达水平显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）;各给药组大鼠的FoxO3a蛋白水平均显著下调,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝中、高剂量组均优于坤泰胶囊组,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。养阴舒肝中剂量组与养阴舒肝其他（低、高）剂量组比较,差异均无统计学意义（P≥0.05）。采用蛋白免疫印迹法检测,与空白组比较,模型组FoxO3a蛋白表达量明显增多,差异有统计学意义（P<0.01）;各给药组大鼠的FoxO3a蛋白表达量均明显减少,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝中、高剂量组优于坤泰胶囊组,差异有统计学意义（P<0.01）。养阴舒肝颗粒呈量效递增关系,养阴舒肝高剂量组优于中剂量组,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。（7）养阴舒肝颗粒对卵巢功能下降大鼠卵巢组织凋亡相关蛋白表达水平的影响（1）卵巢组织Bcl-2蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠的Bcl-2蛋白表达量显著减少,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,各药物干预组大鼠的Bcl-2蛋白表达量均明显增多,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝中剂量组优于坤泰胶囊组,差异均统计学意义（P<0.01）。养阴舒肝中剂量组优于低、高剂量组,差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）卵巢组织Bax蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠Bax蛋白的表达量显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,各给药组大鼠的Bax蛋白表达量均明显减少,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝高剂量组优于坤泰胶囊组,差异有统计学意义（P<0.01）。养阴舒肝各剂量组之间呈量效递增关系,差异均有统计学意义（P<0.01）。（3）卵巢组织Caspase-3蛋白的表达水平:与空白组比较,模型组大鼠的Caspase-3蛋白表达量显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,各给药组大鼠的Caspase-3蛋白表达量均明显减少,差异均有统计学意义（P<0.01）。与对照药物组比较,养阴舒肝中、高剂量组疗效优于坤泰胶囊组,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。养阴舒肝各剂量组之间呈量效递增关系,高剂量组疗效优于中剂量组,差异均有统计学意义（P<0.05）。2.养阴舒肝颗粒的安全性评价实验（1）养阴舒肝颗粒对大鼠一般情况的影响实验期间,各组大鼠均无死亡,也未出现明显的毒性反应。与空白组比较,养阴舒肝各剂量组大鼠的外观体征、行为活动,饮食及排泄物均正常。（2）养阴舒肝颗粒对大鼠血液各项指标的影响与空白组比较,养阴舒肝各剂量组WBC数目、Neu数目及PLT数目的差异均无统计学意义（P≥0.05）;养阴舒肝各剂量组的RBC数目和HGB含量降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（3）养阴舒肝颗粒对大鼠肝肾功能的影响与空白组比较,养阴舒肝各剂量组血清ALT、AST水平的差异均无统计学意义（P≥0.05）;养阴舒肝各剂量组血清BUN、CRE的差异均无统计学意义（P≥0.05）。结论:1.采用连续15天腹腔注射160 mg/kg VCD进行造模,大鼠的动情周期出现延长,造模成功。2.养阴舒肝颗粒可以改善卵巢功能下降大鼠的一般状况,尤以对腹胀改善明显。3.养阴舒肝颗粒可促进卵巢功能下降大鼠动情周期的恢复。4.养阴舒肝颗粒可增加卵巢功能下降大鼠的双侧卵巢重量和卵巢指数。5.养阴舒肝颗粒可改善卵巢功能下降大鼠的卵巢组织结构,使得各级发育卵泡和成熟卵泡的数目呈上升趋势;养阴舒肝颗粒可明显减少闭锁卵泡数目。6.养阴舒肝颗粒可调节卵巢功能下降大鼠的性激素（AMH、FSH及E₂）水平,降低血清FSH水平,升高血清AMH、E₂水平,其中以高剂量疗效明显。7.养阴舒肝颗粒可提高血清GSH-PX、SOD的活力,降低MDA水平,发挥抗氧化效应,其中以高剂量疗效明显。8.养阴舒肝颗粒可调节卵巢组织PI3K/Akt/FoxO3a通路相关蛋白的表达水平,增加PI3K、Akt蛋白的表达量,降低FoxO3a蛋白的表达量。9.养阴舒肝颗粒可调节卵巢组织凋亡相关蛋白的表达水平,增加Bcl-2蛋白的表达量,减少Bax、Caspase-3蛋白的表达量,从而抑制凋亡。10.安全性评价实验中大鼠的一般状况良好,未出现死亡、毒性反应,无明显的肝肾功能的损害,初步表明养阴舒肝颗粒应用的安全性。11.养阴舒肝颗粒可改善卵巢功能下降大鼠的卵巢功能,其机制可能是通过调节了卵巢组织PI3K/Akt/FoxO3a的信号通路及抑制凋亡实现的,且该药具有安全性。本研究为养阴舒肝颗粒的研发与推广应用提供了实验依据。