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研究背景大面积皮肤组织缺损是整形外科修复的难点问题。目前修复缺损方法包括皮片移植、皮瓣移植、异体复合组织移植以及皮肤软组织扩张术等方法。然而,移植皮片颜色、质地与受区差异较大,移植皮片后期常常发生挛缩,取皮部位还可能遗留明显瘢痕;局部皮瓣转移虽能提供与受区相似的皮肤组织,但局部皮瓣难以获取足够组织修复较大创面;同种异体血管化复合组织移植例如颜面移植、手移植等虽然能一次性提供与受区形状、结构、质地相似的组织,但该方法技术难度大,且术后长期使用的免疫抑制剂所带来的毒副作用也限制了其推广。皮肤软组织扩张术作为整形外科常规的技术之一,在临床应用广泛。扩张术能提供与受区颜色、质地相似的“额外”皮肤组织,并且不对供区造成继发损害。尽管如此,扩张术依然存在一系列问题,如皮肤扩张效率不佳、手术周期长、手术并发症相对较多、扩张机制研究不清等问题。因此,进一步研究在机械应力作用下扩张皮肤新生机制十分必要。皮肤的扩张过程,类似一种组织反复损伤、修复的过程。组织损伤后,免疫细胞尤其是单核/巨噬细胞会迁移到损伤部位,参与坏死细胞的清除以及组织修复与再生。根据表型以及功能的不同,巨噬细胞可以分为M1型巨噬细胞以及M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞能够分泌炎性因子如白介素1β（Interleukin 1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）、白介素6（Interleukin 6,IL-6）、干扰素γ（Interferonγ,IFN-γ）、基质金属蛋白酶1（Matrix metalloproteinase 1,MMP-1）等,参与坏死组织清除以及细胞外基质降解;M2型巨噬细胞能够分泌抑炎因子如白介素4（Interleukin 4,IL-4）、白介素10（Interleukin 10,IL-10）、转化生长因子β（Transforming growth factorβ,TGF-β）等参与组织修复,参与基质与胶原合成。近期,研究还表明,巨噬细胞是肝、肾、骨骼肌等组织损伤后修复与再生的关键;巨噬细胞还是蝾螈、斑马鱼等动物肢体再生启动的关键。目前,皮肤在扩张过程中是否有巨噬细胞持续表达以及巨噬细胞在扩张过程的作用还并不清楚。探究扩张过程中巨噬细胞数量、亚型变化及其参与扩张皮肤新生的机制,对于我们进一步认识扩张皮肤新生机理,寻找新靶点以提高扩张效率、降低扩张并发症具有重要意义。研究目的探究在扩张过程中皮肤巨噬细胞数量的动态变化及亚型转换,研究巨噬细胞在皮肤扩张过程中的作用及机制。研究方法1)本实验利用10 mL圆形皮肤软组织扩张器来构建大鼠背部皮肤扩张模型。模型构建成功后,将实验动物分为扩张组及假扩张组。分别于扩张术后第1天、第3天、第7天、第14天、第35天取材,采用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察皮肤扩张过程中的一般组织学变化,利用CD68免疫组化/免疫荧光染色检测扩张过程中巨噬细胞的表达,并对比扩张组与假扩张组巨噬细胞数量的差异。随后,利用iNOS+CD68+标记M1型巨噬细胞,利用CD206+CD68+标记M2型巨噬细胞,统计各个时间点皮肤中、包膜中各亚型巨噬细胞的数量及其变化趋势。收集各个时间点扩张皮肤标本进行RNA提取和反转录,最后利用实时定量聚合酶链反应（quantitative Polymerase chain reaction,qPCR）来检测M1型巨噬细胞相关细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α以及M2型巨噬细胞相关细胞因子如IL-10、TGF-β等的变化。2)巨噬细胞能特异性识别氯磷酸盐脂质体并发生凋亡,我们研究拟利用氯磷酸盐脂质体局部注射来特异性耗竭扩张皮肤中的巨噬细胞。首先,我们设计实验构建扩张全期巨噬细胞耗竭模型以及自身对照模型:于扩张皮瓣两侧对称部位设计大小为1.5 cm×1 cm用药区域,间隔1 cm,分别在扩张术后第0天、第3天、第10天对一侧皮下注射40μL氯磷酸盐脂质体,对侧注射等量磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer,PBS）脂质体作为对照;分别在术后第7天、第14天、第35天取材进行CD68免疫荧光染色;模型构建成功后,将动物分为扩张组和假扩张组,两组动物均皮下注射氯磷酸盐脂质体以及PBS脂质体,分别在扩张的第7天、第14天以及第35天取材。记录扩张各时期巨噬细胞耗竭扩张皮肤的面积及对照扩张皮肤的面积;对扩张各个时间点的皮肤组织进行HE染色后,利用ImageJ软件测量各组扩张皮肤的厚度;对各组皮肤进行Masson染色,利用Image-Pro Plus 6.0软件对胶原着色面积进行测量;利用经皮氧分压仪,对扩张术后第14天以及第35天扩张皮肤两侧进行经皮氧分压（Transcutaneous oxygen pressure,TcPO2）测量;对扩张第14天及35天皮肤进行增殖细胞核抗原（Proliferation cell nuclear antigen,PCNA）免疫荧光染色,探查增殖活跃细胞数量变化;对扩张第14天及35天皮肤进行Isolectin免疫荧光染色,探查皮肤中血管数量的变化;提取扩张第14天及35天皮肤总RNA,反转录后利用qPCR检测表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast growth factor,bFGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、TGF-β1水平变化。3)体外培养RAW 264.7小鼠巨噬细胞系,采用含100 ng/mL脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）以及25 ng/mL IFN-γ的培养基诱导巨噬细胞向M1转变,采用含40 ng/mL IL-4的培养基诱导巨噬细胞向M2转变;诱导完成后,采用流式细胞术以PE标记的CD11c来识别M1型巨噬细胞,以APC标记的CD206来识别M2型巨噬细胞,记录M1及M2型巨噬细胞诱导的阳性率;提取诱导成功M1、M2以及M0型巨噬细胞的总RNA、随后反转录为cDNA,最后利用qPCR探查各型巨噬细胞中VEGF、EGF、bFGF以及TGF-βmRNA水平变化;体外分离培养胎鼠成纤维细胞,培养传代细胞至P3时,分别用M0、M1、M2型巨噬细胞上清培养24小时,随后提取成纤维细胞总RNA,利用qPCR检测成纤维细胞受到不同亚型巨噬细胞上清刺激后I型胶原mRNA水平变化。研究结果1)本实验成功构建了大鼠背部恒压扩张模型;研究发现,扩张皮肤中的巨噬细胞在第14天（P<0.01）和第35天（P<0.0001）均明显高于假扩张组皮肤,提示扩张过程中皮肤巨噬细胞一直维持在较高水平;免疫荧光双染色结果显示扩张第7天,CD68+iNOS+M1巨噬细胞占主导地位,扩张第14天（P<0.01）与扩张第35天（P<0.0001）M1细胞数量明显下降,而在扩张第35天CD206+CD68+M2型巨噬细胞数量要高于扩张第7天（P<0.05）;扩张第1天及第3天包膜M1型巨噬细胞所占比例高于第7、14、35天（P<0.05）,而包膜中M2细胞占比在各个时间点均无明显差异;通过qPCR实验,我们发现M1相关细胞因子如IL-1β、IL-6以及TNF-α在第1天高于其它时间点,M2相关的抑炎因子如IL-10在第1天和第3天均高于其它时间点（P<0.05）。2)本实验利用氯磷酸盐脂质体成功构建了扩张皮肤局部巨噬细胞耗竭模型,该模型能够维持扩张整个时期,实验侧皮肤巨噬细胞数量远低于对照侧（P<0.05）;我们发现扩张组巨噬细胞耗竭侧皮肤面积在第14天、第28天、第35天均明显小于对照侧（P<0.01）;通过HE染色分析发现,扩张组巨噬细胞耗竭侧皮肤的厚度明显低于对照侧（P<0.01）;假扩组两侧皮肤面积及厚度均无明显差异;通过Masson染色发现,扩张组巨噬细胞耗竭皮肤在扩张过程中（第14天以及第35天）胶原所占比例明显下降（P<0.01）;随后免疫荧光染色结果显示,扩张第14天以及第35天,巨噬细胞耗竭侧皮肤增殖活跃细胞（PCNA+）数量明显少于对照侧（P<0.001）;Isolectin免疫荧光染色显示,扩张第14天以及第35天,巨噬细胞耗竭侧皮肤中血管数量明显低于对照侧（P<0.05）,第35天,巨噬细耗竭侧扩张皮肤的TcPO2明显低于对照侧（P<0.05）;通过qPCR实验发现,巨噬细胞耗竭侧VEGF、EGF、bFGF、TGF-βmRNA水平在第14天明显低于对照侧（P<0.05）。3)本实验利用含100 ng/mL LPS和25 ng/mL IFN-γ培养基成功将RAW 264.7巨噬细胞诱导为M1型,利用含40 ng/mL IL-4培养基将巨噬细胞诱导为M2型,M1型巨噬细胞诱导阳性率在80%-94%之间,而M2型巨噬细胞诱导阳性率在60%-80%之间;通过qPCR实验发现M1型巨噬细胞VEGF水平较M0及M2型巨噬细胞高（P<0.05）,M2型巨噬细胞的bFGF以及TGF-β的mRNA水平较M0及M1型巨噬细胞高（P<0.05）;M2型巨噬细胞上清相比M0或者M1型巨噬细胞更能刺激胎鼠成纤维细胞I型胶原的表达（P<0.05）。研究结论1)大鼠背部皮肤扩张模型是一种稳定的动物皮肤扩张模型;皮肤在扩张过程中,CD68阳性巨噬细胞一直维持在较高水平。在扩张术早期M1型巨噬细胞占主导地位,在扩张后期M2型巨噬细胞占主导地位。2)氯磷酸盐脂质体局部应用能够构建稳定的皮肤巨噬细胞耗竭模型;巨噬细胞耗竭后扩张皮肤出现新生障碍,表现在扩张面积减小、扩张皮肤厚度降低、真皮胶原含量占比下降。其中的机制可能与巨噬细胞耗竭后局部增殖活跃细胞减少、血管化变差以及局部生长因子水平下降有关。3)巨噬细胞极化后,相关生长因子表达水平明显升高,M2型巨噬细胞能够通过分泌相关因子诱导成纤维细胞胶原合成增加。