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目的:探讨利福平对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)寡聚体水平的影响及其与细胞自噬的关系。方法:1.建立PD细胞模型:以不同浓度鱼藤酮(0uM、2.5uM、5uM、10uM、25uM)处理SH-SY5Y细胞24小时,通过MTT法检测细胞增殖并计算细胞存活率,以正常对照组细胞存活率的50%~70%为标准确定最佳浓度(5uM)并建立PD细胞模型。2.设立利福平治疗组与利福平对照组:在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中,以不同浓度利福平(0uM、50uM、100uM、150uM、300uM)处理细胞24小时,通过MTT法检测细胞增殖并以最大细胞存活率确定利福平治疗的最佳浓度(150uM),作为利福平治疗组;将该浓度利福平直接作用于SH-SY5Y细胞24小时作为利福平对照组。3.确立自噬工具药作用于SH-SY5Y细胞的最佳工作浓度和工作时间:将自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)按照0uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM的密度梯度处理细胞,自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)按0uM、0.01uM、0.1uM、1uM、5uM的密度梯度处理细胞,24小时后通过MTT法检测细胞增殖,以不损伤细胞存活率的最高浓度确定工具药氯喹和雷帕霉素在SH-SY5Y细胞的最佳处理浓度(分别为10uM、10nM);将10uM氯喹按0小时、0.5小时、1小时、2小时的时间梯度作用于SH-SY5Y细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测自噬标志蛋白beclin-1的含量,以beclin-1表达最低为标准确定氯喹在SH-SY5Y细胞的最佳处理时间(1小时);将10nM雷帕霉素按0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时的时间梯度作用于SH-SY5Y细胞并检测beclin-1的含量,以beclin-1表达最高为标准确定雷帕霉素在SH-SY5Y细胞的最佳处理时间(2小时)。4.调节自噬观察生理、病理条件下自噬与底物α-syn寡聚体的关系:以氯喹(10uM,1小时)作用于正常对照SH-SY5Y细胞,通过蛋白质免疫印迹法观察beclin-1和病理标志物α-syn寡聚体含量的变化,以明确在多巴胺能细胞中自噬抑制与底物α-syn寡聚体的关系;以雷帕霉素(10nM,2小时)预处理SH-SY5Y细胞,再加入鱼藤酮(5uM,24小时),通过蛋白质免疫印迹法观察beclin-1和病理标志物α-syn寡聚体含量的变化,以明确PD细胞模型中促进自噬与其底物α-syn的关系。5.观察利福平的神经保护效应及其对PD细胞模型中自噬及其底物的影响:分别对SH-SY5Y细胞对照组、PD模型组、利福平治疗组和利福平对照组进行检测:通过流式法检测各组细胞凋亡率;通过qRT-PCR技术检测各组病理标志蛋白α-syn的mRNA(SNCA)的表达水平;通过蛋白质免疫印迹法检测各组α-syn寡聚体含量和自噬相关蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62的含量。6.PD细胞模型建立后,在利福平处理之前,以自噬抑制剂氯喹预处理细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测α-syn寡聚体含量,以明确自噬抑制能否抵消利福平的治疗作用。7.通过透射电子显微镜对各组细胞的自噬小体、自噬溶酶体等进行自噬形态学的直接观察。结果:1.鱼藤酮抑制SH-SY5Y细胞增殖,呈浓度依赖性(P<0.001),以细胞存活率50%~70%作为标准,确定以5uM鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞24小时建立PD细胞模型。2.相对于PD细胞模型组,利福平(150uM,24小时)治疗有效提高约30%的细胞存活率(P<0.001),降低14%的细胞凋亡率(P<0.001),提示利福平具有神经元保护作用。3.自噬抑制剂氯喹和自噬诱导剂雷帕霉素对SH-SY5Y细胞自噬水平的调节作用具有浓度、时间相关性,与SH-SY5Y细胞对照组(0.47±0.02)比较:10uM氯喹处理1小时后beclin-1相对表达量最低(0.12±0.02,P<0.001),10nM雷帕霉素处理2小时后beclin-1相对表达量最高(0.66±0.03,P<0.01)。4.与SH-SY5Y细胞对照组比较,氯喹处理SH-SY5Y细胞减少自噬标志蛋白beclin-1的表达(0.31±0.04 vs 0.95±0.01,P<0.001),增加α-syn寡聚体含量(0.67±0.04 vs 0.32±0.03,P<0.001),说明多巴胺能细胞中自噬抑制时自噬底物α-syn寡聚体增加;与PD细胞模型组比较,雷帕霉素预处理显著增加beclin-1的表达(0.60±0.05 vs 0.28±0.04,P<0.01),减少α-syn寡聚体含量(0.44±0.03 vs0.59±0.03,P<0.05),表明PD细胞模型中通过促进自噬有利于减少底物α-syn寡聚体的含量。5.与PD模型组比较,利福平治疗组SNCA的相对表达量下降(1.31±0.31 vs2.58±0.74,P<0.05),α-syn寡聚体含量明显减少(0.39±0.30 vs 0.55±0.36,P<0.05),自噬相关蛋白beclin-1增加(1.05±0.03 vs 0.51±0.01,P<0.001),LC3-Ⅱ/Ⅰ水平提高(0.68±0.03 vs 0.31±0.05,P<0.001),自噬底物标志蛋白p62含量下降(0.38±0.03 vs 0.81±0.08,P<0.001)。提示利福平降低α-syn寡聚体含量与其促进自噬和抑制α-syn mRNA表达有关。6.与利福平治疗组比较,在PD模型建立后,利福平治疗之前使用氯喹预处理显著增加细胞内α-syn寡聚体含量(0.95±0.03 vs 0.41±0.04,P<0.001)。提示抑制自噬可以抵消利福平的降低细胞内α-syn寡聚体含量的保护效应。7.与PD模型组比较,利福平处理组在透射电子显微镜下表现出更多的自噬小体和自噬溶酶体数量,提示利福平治疗可能促进自噬成熟。结论:在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中自噬水平下降,α-syn寡聚体增加,利福平对多巴胺能细胞的保护效应可能通过促进细胞自噬从而降低α-syn寡聚体的含量而实现,抑制自噬可以抵消利福平这样的保护效应。