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柑橘溃疡病是一种由柑橘黄单胞杆菌柑橘变种(Xanthomononas citri subsp.citri,Xcc)引起的细菌性病害,该病会导致落叶、树势衰退、落果、果实产生溃疡斑、品质变差等症状,严重影响柑橘的产量和商品价值是威胁全球柑橘产业的的重大检疫性病害。该病主要通过带菌种苗或接穗远距离传播,而田间近距离扩散主要与暴风雨或农事活动有关。柑橘溃疡病菌在枝、叶、果实等部位的存活时间比较长,这对于该病害的检验检疫和防治防控是巨大的挑战。目前,柑橘溃疡病的检测主要依赖定量PCR技术。定量PCR技术具有较高的特异性、灵敏性、闭管反应等优势,但仍存在技术方法的局限性,诸如依赖外部参照(核酸标准物质或对照样本)才能定量,受PCR扩增效率变化影响大,易受PCR抑制物影响,以及假阴性等问题。因此定量PCR并不能很好地满足植物病害检验检疫工作的需要。微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术是第三代核酸定量检测技术,采用PCR终点检测和泊松分布原理实现核酸样本的绝对定量,具有更高的精确性、特异性以及灵敏度,无需标准物质,无需标建立准曲线,不依赖PCR扩增效率,不易受PCR抑制剂的影响,能准确测定低丰度样本拷贝数。目前,ddPCR在医学临床诊断上的应用逐渐兴起,但在植物学研究、植物病害检验检疫方面的报道很少。本研究旨在评估微滴数字PCR与定量PCR两种方法在柑橘溃疡病检测应用中的各项性能,为柑橘溃疡病的快速鉴定、病害预测预报、病害流行学研究以及Xcc标准物质的制备提供更为有效的技术方法。本研究参考现行有效的柑橘溃疡病检测标准(GB/T 28068-2011)报道的引物探针和对应的柑橘溃疡病菌的独有保守蛋白基因,运用引物设计软件调整筛选出特异性引物和探针,扩增保守蛋白基因的片段并构建的重组质粒,制备标准品;本研究对柑橘溃疡病菌悬液、重组质粒、酶切后的质粒、田间样品分别用qPCR和ddPCR进行了检测,主要结果如下:(1)检测特异性和灵敏度:以柑橘叶片腐生非致病菌为对照,验证了引物和探针的特异性。比较两种方法对系列稀释的Xcc菌悬液和质粒DNA的检测结果发现,两种方法均具有很好的线性。虽qPCR的动态范围比ddPCR广,但是ddPCR的灵敏度比qPCR高。ddPCR对菌悬液和质粒DNA的检测下限分别为5 CFUs/20μL和6.4 copies/20μL;而qPCR对菌悬液和质粒DNA的检测下限分别为36 CFUs/20μL和12 copies/20μL。(2)DNA模板构象的影响:对比相同拷贝数浓度的酶切线性化质粒和环状质粒的qPCR检测结果发现环状质粒的Cq值会显著大于线性质粒的Cq值,导致检测结果偏低;而尽管环状质粒会使ddPCR的1-Dimension散点图上出现较多的“雨点(Rainning)”,但定量结果与相同拷贝数浓度的线性质粒DNA无显著差别。(3)检测重复性:对高、中、低不同浓度的质粒和菌悬液样品重复定量三次的实验结果表明ddPCR比qPCR具有更好的重复性,其变异系数降低了9.19%–69.44%。(4)PCR抑制物耐受性:对于柑橘组织液、王铜杀菌剂、硫酸铜溶液三种PCR抑制剂,ddPCR表现出对PCR抑制成分的更高耐受度,定量结果不易受抑制因子干扰,这与ddPCR在PCR终点检测荧光信号以及基于泊松分布概率密度函数的数学模型有关。(5)田间样品实测:回归分析表明,对于相同的样本,ddPCR与qPCR的检测结果相关性较强(皮尔逊相关系数R2=0.7453,P<0.001);受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析,ddPCR检测方法的AUC(ROC曲线下的面积值)为0.8697,而qPCR检测为0.7431,说明ddPCR的诊断的灵敏度和特异性优于qPCR。结论:综合比较表明ddPCR抗干扰性好,对试样要求低,适用于检测各种简易制备的柑橘溃疡病样品,具有更高的诊断特异性和灵敏度,且重复性好,摒弃了对核酸标准品的依赖。综上所述,本研究探讨了qPCR与ddPCR在检测柑橘溃疡病的差异,优化了ddPCR检测体系,初步建立了ddPCR方法用于柑橘实际样品的检疫检验方法为柑橘溃疡病检验检疫提供更精准、更可靠的技术手段。